论文摘要
第一部分三氧化二砷诱导人胆囊癌GBC细胞凋亡及其机制研究背景与目的:胆囊癌由于缺乏特异性的临床表现,确诊时多属晚期,手术切除率较低;且常规化疗药物对胆囊癌的疗效较差,因此需寻找治疗胆囊癌新的有效药物。三氧化二砷（As2O3）在治疗急性早幼粒细胞白血病中取得了突破性成果,近年来它在实体瘤的研究中颇受关注。本研究旨在探讨As2O3,对人胆囊癌GBC细胞系诱导凋亡的生物学效应及BcL-2在其中的作用。方法:用Hoechest33258染色、流式细胞仪和DNA凝胶电泳研究As2O3,诱导细胞凋亡情况。用Western blot分析As2O3对凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Bid、Bak、Bax、cleaved-Caspase-3和cleared-Caspase－9的表达影响。构建Bcl-2的表达质粒,并用Lip02000转染GBC细胞,并检测As2O3诱导细胞凋亡情况。结果:As2O3可诱导GBC细胞凋亡。蛋白水平的检测表明As2O3,可使细胞Bcl-2、Bcl-xL的表达下降,Bid、Bak和Bax表达升高,并促进Caspase-3和Caspase-9的剪切。过表达Bcl-2可抑制As2O3诱导的凋亡。结论:As2O3可诱导胆囊癌细胞的凋亡,并主要通过下调Bcl-2基因的表达来实现。第二部分三氧化二砷抑制人胆囊癌细胞生长及机制研究背景与目的:恶性肿瘤发生和发展固有的特点是肿瘤细胞无节制的生长,这与细胞周期的调控异常密切相关。细胞周期D类蛋白与细胞周期调控密切相关,过表达的细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）参与了胆囊癌的发生和发展,转录因子Spl在多种与细胞生长相关基因的转录调控中起激活作用,本研究旨在探讨As2O3对人胆囊癌GBC细胞系生长的生物学效应及Cyclin D1、转录因子Spl在其中的作用。方法:不同浓度的As2O3作用于胆囊癌细胞GBC-SD,MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期分布。Western blot和RT-PCR检测CyclinD1、D2、D3、CDK4和CDK6的蛋白和mRNA表达。构建Cyclin D1的表达质粒并转染GBC细胞,观察Cyclin D1过表达时细胞周期的变化。构建Cyclin D1启动子pGL3并转染GBC细胞,测定不同浓度As2O3作用下pGL3相关的荧光素酶活性。Western blot测定转录因子Spl蛋白表达并构建其表达质粒转染GBC细胞,测定转染前后Cyclin D1启动子相关的荧光素酶活性。结果As2O3能抑制胆囊癌细胞生长,作用呈时间、剂量-效应关系;流式细胞仪检测发现As2O3可将增殖过程中的胆囊癌细胞阻滞于G1期:Western blot及RT-PCR检测显示Cyclin D1蛋白和mRNA的表达下降;As2O3能降低Cyclin D1启动子的表达,作用呈剂量-效应关系,4μmol/L的As2O3处理后Cyclin D1的启动子活性下调近70%,过表达Cyclin D1逆转了As2O3对细胞周期的改变。As2O3能降低转录因子Spl的表达及Cyclin D1启动子的活性,外源性Spl能逆转As2O3对Cyclin D1启动子活性的抑制作用。结论:AsO3能明显抑制体外人胆囊癌GBC细胞的生长并主要通过Spl介导的Cyclin D1表达下调来实现。
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