小麦成熟胚再生体系优化和ppo-RNAi构件的遗传转化

论文摘要

面粉白度是衡量小麦品质的重要性状之一，受遗传和环境影响。其中，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是引起面条(团)颜色褐变的主要原因。研究表明降低籽粒PPO活性可以改良小麦面粉白度，因此可以通过基因转化、RNAi等基因工程方法来降低内源PPO基因的表达，抑制PPO的活性，增加面粉白度等。本研究首先进行了小麦成熟胚再生体系的优化和优良基因型的筛选，其次利用ppo基因构建了植物RNAi载体，分别用基因枪法和农杆菌介导法转化小麦（保丰104和科农199）胚性愈伤组织，通过DNA、RNA和蛋白质多级筛选、分析得到的阳性转基因小麦植株。并对保丰104T1、T2和中优9507T3、T4代转基因植株进行了跟踪检测，就外源基因遗传特点和后代农艺性状进行了分析研究。获得的主要的研究结果如下：⑴小麦成熟胚的诱导和分化再生与其基因型有密切关系，部分基因型小麦成熟胚的愈伤诱导能力差别较大，各基因型的愈伤质量、胚芽率、分化率和生根率差异显著。筛选到了鲁麦14、济麦21、山农20、良星66、良星99和科农199等几个品种(系)可以作为良好的受体基因型进行更深一步的研究。⑵用基因枪法和农杆菌法分别共转化保丰104和科农199的愈伤组织，保丰104获得16株阳性植株，科农199获得一株阳性植株。⑶分别在DNA、RNA和蛋白质水平上对转基因后代植株进行逐代检测，共筛选到保丰104有17个植株转基因植株的PPO活性减弱，中优9507有30棵植株的酶活有所降低。说明RNAi构件在转基因后代株系中获得了表达，并抑制了内源目标基因的表达。⑷农艺性状调查结果表明，无论是对照植株还是转基因后代，其植株间在穗长、株高、单株分蘖数以及穗粒重等主要农艺性状上没有明显差异。以上结果表明，外源基因在小麦植株可以稳定表达，并且可以逐代稳定遗传，转基因后代，在主要农艺性状上与对照植株没有明显差异，这为改良面粉白度的转基因小麦新品种的实际利用提供了科学依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1小麦转基因技术研究现状
• 1.1.1 不依赖于原生质体的转化方法
• 1.1.1.1 基因枪法
• 1.1.1.2 农杆菌介导法
• 1.1.1.3 花粉管通道法
• 1.1.1.4 低能离子束介导法
• 1.1.2 依赖于原生质体的转化方法
• 1.1.2.1 PEG 法
• 1.1.2.2 电激法
• 1.1.2.3 脂质体转化法
• 1.2 小麦品质改良转基因现状
• 1.2.1 小麦籽粒硬度转基因
• 1.2.2 小麦面粉白度转基因
• 1.2.3 小麦淀粉品质转基因
• 1.2.4 小麦营养品质转基因
• 1.2.5 小麦烘烤品质转基因
• 1.3 存在的问题及前景展望
• 1.3.1 小麦转基因技术的发展还不够成熟
• 1.3.2 小麦转基因育种的功能基因还非常有限
• 1.3.3 转基因小麦的生物安全性仍是研究重点
• 1.3.4 转基因育种是分子育种的主要途径之一
• 1.3.5 转基因方法的展望
• 1.4 小麦多酚氧化酶（PPO）和 RNAi 载体
• 1.4.1 多酚氧化酶
• 1.4.1.1 多酚氧化酶的种类、分布及对品质的影响
• 1.4.1.2 多酚氧化酶的遗传及分子生物学研究
• 1.4.1.3 多酚氧化酶的提取与活性测定
• 1.4.2 RNAi 载体
• 1.4.2.1 RNAi 原理
• 1.4.2.2 RNAi 载体构建以及相关载体的利用
• 1.5 本研究的研究背景、研究意义和技术路线
• 1.5.1. 背景和意义
• 1.5.2 技术路线
• 2 试验材料与方法
• 2.1 试验材料、试剂与仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 小麦成熟胚再生培养体系的优化
• 2.2.2 基因枪转化方法
• 2.2.2.1 转化载体的制备及纯化
• 2.2.2.2 金粉制备及子弹包裹
• 2.2.2.3 基因枪的轰击
• 2.2.2.4 培养基的制备
• 2.2.3 农杆菌转化方法
• 2.2.3.1 pROK2-ppo-RNAi 农杆菌表达载体的构建和转化
• 2.2.4 转基因植株的检测及筛选
• 2.2.4.1 转基因植株叶片总 DNA 提取——CTAB 改良法
• 2.2.4.2 转基因植株的 PCR 检测
• 2.2.4.3 转基因小麦籽粒总 RNA 提取及半定量 RT-PCR
• 2.2.4.4 转基因小麦籽粒 PPO 同工酶的提取
• 2.2.4.5 转基因小麦籽粒的 PPO 同工酶的非变性不连续 PAGE 胶电泳
• 2.2.4.6 转基因小麦籽粒 PPO 同工酶的活性测定
• 2.2.5 转基因后代植株的农艺性状调查
• 3 结果与分析
• 3.1 优良转基因受体基因型的筛选及小麦成熟胚再生培养体系的优化
• 3.1.1 基因型和诱导培养基对小麦成熟胚出愈率的影响
• 3.1.2 基因型和诱导培养基对小麦成熟胚直接发芽率的影响
• 3.1.3 基因型和诱导培养基对小麦成熟胚愈伤组织质量的影响
• 3.1.4 基因型和分化培养基对小麦成熟胚离体培养的影响
• 3.1.5 基因型和生根培养基对小麦成熟胚离体培养的影响
• 3.2 基因枪转化愈伤
• 3.3 农杆菌转化愈伤
• 3.4 转基因后代的检测及筛选
• 3.4.1 转基因植株总 DNA 的提取
• 3.4.2 转基因植株的 intron PCR 检测
• 3.4.2.1 T0转基因植株的 intron PCR 检测
• 3.4.2.2 T1代转基因植株的 intron PCR 检测
• 3.4.2.3 T3代转基因植株的 intron PCR 检测
• 3.4.3 转基因植株的 bar 基因 PCR 检测
• 3.4.3.1 T1代转基因植株的 bar 基因 PCR 检测
• 3.4.3.2 T3代转基因植株的 bar 基因 PCR 检测
• 3.4.4 转基因小麦籽粒的半定量 RT-PCR （Semi-Quantitative RT-PCR）检测
• 3.4.5 转基因小麦籽粒的 PPO 同工酶的非变性不连续 PAGE
• 3.4.6 转基因小麦籽粒 PPO 同工酶的活性测定
• 3.5 农艺性状调查结果
• 4 讨论
• 4.1 小麦成熟胚体系优化分析
• 4.2 转基因植株的获得方法
• 4.3 转基因对后代植株农艺性状的影响
• 5 结论
• 5.1 小麦成熟胚体系优化
• 5.2 转基因植株的获得和检测筛选
• 5.3 转基因后代的农艺性状
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文情况