猪繁殖与呼吸综合征病毒多基因重组真核表达质粒的构建及免疫学研究

论文摘要

本研究试图应用分子生物学试验方法构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3、ORF5、ORF6基因的真核重组质粒,并进行小鼠的免疫试验,以探讨所构建核酸疫苗的免疫保护作用。试验由3部分构成:1.采用RT-PCR方法克隆得到猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3、ORF5的基因序列,将ORF3和ORF5基因在克隆载体pMD18-T上串联后,将其定向插入真核表达质粒pcDNA4.0多克隆位点,琼脂糖电泳和测序表明成功构建包含猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3、ORF5基因的重组质粒pcDNA4.0-ORF3-ORF5。2.将ORF6和ORF3-ORF5基因串联后,定向克隆到真核表达质粒pcDNA4.0上,构建了重组真核表达质粒pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5。序列测定证明,重组质粒pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5包含完整的ORF6、ORF3和ORF5基因,从而为其免疫试验的研究奠定了基础。3.重组真核表达质粒pcDNA4.0-ORF3-ORF5、pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5经转化、提取和纯化后,小鼠后肢胫前肌注射100μg/只（50μg/腿）,共2次,间隔2周。每隔7 d采血1次,检测ELISA抗体效价和血清中和抗体水平。并分不同时间段采集组织样品,通过PCR检测pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5质粒在小鼠体内的动态分布情况。结果显示,血清抗体水平首免后逐渐增高,2免后14～21 d逐渐达到高峰,且重组质粒组产生的抗体水平明显高于空载体对照组。重组质粒免疫组小鼠于2免后第7 d就能检测到中和抗体,随后快速上升,于第42 d达到最高。说明所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生特异性免疫反应。重组真核表达质粒pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5肌注小鼠后7 d可在肌肉、心、血液、肝、脾、肺、肾及脑组织中检测到,在血液、心肌中可存留84 d,注射部位肌肉存留时间最长,98 d时仍可检测到。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 猪繁殖与呼吸综合征研究概述
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征的流行病学特点
• 1.2 猪繁殖与呼吸综合征的临床症状和病理学变化
• 1.2.1 临床症状
• 1.2.2 病理变化
• 1.3 猪繁殖与呼吸综合征的诊断
• 1.3.1 血清学诊断技术
• 1.3.2 分子生物学诊断技术
• 1.3.3 其它检测技术
• 1.4 猪繁殖与呼吸综合征的防治
• 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒概述
• 2.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的理化性质
• 2.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组结构及其研究进展
• 2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因变异与侵入机理
• 2.3.1 病毒基因变异与重组
• 2.3.2 病毒的侵入机理
• 2.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组编码蛋白的结构与功能
• 2.4.1 主要结构蛋白
• 2.4.2 次要结构蛋白
• 第三章 猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研究进展
• 3.1 PRRS 传统疫苗
• 3.1.1 PRRS 灭活疫苗
• 3.1.2 PRRS 弱毒疫苗
• 3.2 PRRS 新型疫苗研究进展
• 3.2.1 基因疫苗
• 3.2.2 亚单位疫苗
• 3.2.3 活载体疫苗
• 3.3 展望
• 第四章 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3、ORF5 双基因重组真核表达载体的构建
• 4.1 材料
• 4.1.1 PRRSV 病料与工程菌
• 4.1.2 引物的设计和合成
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.1.5 培养基及配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 ORF3、ORF5 基因的获得
• 4.2.2 克隆载体pMD-ORF3 的构建
• 4.2.3 克隆载体pMD-ORF3 的PCR 与酶切鉴定
• 4.2.4 克隆载体pMD-ORF3-ORF5 的构建
• 4.2.5 克隆载体pMD-ORF3-ORF5 的鉴定
• 4.2.6 重组真核表达载体pcDNA4.0-ORF3-ORF5 的构建
• 4.2.7 真核表达载体pcDNA4.0-ORF3-ORF5 的鉴定
• 4.3 结果
• 4.3.1 ORF3、ORF5 基因的获得
• 4.3.2 克隆载体pMD-ORF3 的PCR 与酶切鉴定
• 4.3.3 克隆载体pMD-ORF3-ORF5 的鉴定
• 4.3.4 真核表达载体pcDNA4.0-ORF3-ORF5 的鉴定
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3、ORF5、ORF6 三基因重组真核表达载体的构建
• 5.1 材料
• 5.1.1 质粒、PRRSV 病料与工程菌
• 5.1.2 引物的设计和合成
• 5.1.3 主要试剂
• 5.1.4 主要仪器
• 5.1.5 培养基及配制
• 5.2 方法
• 5.2.1 ORF6 基因的获得
• 5.2.2 重组真核表达载体pcDNA4.0-ORF6 的构建
• 5.2.3 真核表达载体pcDNA4.0-ORF6 的鉴定
• 5.2.4 真核表达载体pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5 的构建
• 5.2.5 真核表达载体pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5 的鉴定
• 5.3 结果
• 5.3.1 ORF6 基因的获得
• 5.3.2 真核表达载体pcDNA4.0-ORF6 的鉴定
• 5.3.3 真核表达载体pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5 的鉴定
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 重组真核表达质粒注射小鼠的免疫学研究
• 6.1 材料
• 6.1.1 质粒和菌种
• 6.1.2 试验动物
• 6.1.3 主要试剂及配制
• 6.1.4 主要仪器
• 6.2 方法
• 6.2.1 重组质粒的大量提取与纯化
• 6.2.2 试验小鼠分组及采样
• 6.2.3 血清抗体的ELISA 检测
• 6.2.4 血清中和抗体的检测
• 6.2.5 pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5 在小鼠体内的动态分布
• 6.3 结果
• 6.3.1 血清抗体的ELISA 检测
• 6.3.2 血清中和抗体的检测
• 6.3.3 pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5 在小鼠体内的动态分布
• 6.4 讨论
• 6.4.1 重组真核表达质粒疫苗的免疫保护效果
• 6.4.2 影响重组真核表达载体疫苗免疫效果的因素
• 6.4.3 重组真核表达载体疫苗面临的问题及应用前景
• 6.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介