偶氮染料高效降解基因工程菌构建与特性研究

论文摘要

偶氮染料的生物降解已得到较为深入的研究，分离得到多种具有偶氮染料脱色活性的微生物，并有数种偶氮还原酶基因经大肠杆菌表达获得高纯度、高效率的偶氮还原酶，但是酶制剂的应用受到各种条件的限制，成本较高。因此，考虑提高微生物本身的偶氮染料脱色活性，以便于工程应用。 本文的目的是构建一株具有较高偶氮染料脱色活性的基因工程菌，并考察其对偶氮染料的脱色特性。该工程菌是以沼泽红假单胞菌／大肠杆菌穿梭质粒为载体，将外源基因（来自球形红细菌Rhodobacter sphaeroides AS1.1737的偶氮还原酶基因）导入受体菌（沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris AS1.2352），使受体菌表达外源偶氮还原酶，从而提高该工程菌的偶氮染料脱色能力。为达到以上目标，首先，在工程菌构建之前，通过考察外源偶氮还原酶基因的供体菌（球形红细菌）和受体菌（沼泽红假单胞菌）的偶氮染料脱色活性，以及受体菌细胞中质粒DNA的种数及其复制等相关情况，验证该构建途径的可行性；进而构建穿梭质粒及工程菌；最后，以原始受体菌为对照，考察工程菌的生长及脱色特性。 对球形红细菌Rhodobacter sphaeroides AS1.1737的菌体及其胞内粗酶的偶氮染料脱色活性进行考察。菌体在光照缺氧条件可将多种偶氮染料脱色，部分染料24小时脱色率可达90％以上。染料不能作为该菌生长的唯一碳源。35-40℃，中性偏碱环境（pH7-8）具有较高脱色率。超声破碎菌体，获得胞内粗酶，经Red Sepharose CL-6B凝胶纯化，粗酶中偶氮还原酶的含量有一定提高。以甲基橙作为模型染料时，50℃、pH 8.0为其粗酶酶促反应的最佳条件，并且该酶催化的脱色反应符合双底物的乒乓机理。甲基橙、NADH表观米氏常数分别为0.45 mM和1.25 mM。 前期研究发现，沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris AS1.2352具有偶氮染料脱色能力，其胞内粗酶亦具有偶氮还原酶活性，催化过程符合乒乓机理。而纺织印染助剂中包括多种表面活性剂，对生物具有一定的毒性，因此，考察表面活性剂对该菌脱色能力的影响具有实际意义。实验发现，该菌对两种阴离子表面活性剂（LAS，Sodiumlinear alkylbenzene sulphonate；SDS，Sodium dodecyl sulfate）有较强的耐受能力，并且能够在好氧条件下将其降解；LAS对菌体生长的抑制作用明显大于SDS；0.1％ SDS存在时染料脱色受到一定的抑制，较高温度（30℃以上）时，抑制情况随温度提高迅速加重。 为考察沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris AS1.2352中存在的质粒DNA的情况，根据该菌的特点和常规提取方法应用中遇到的问题，在碱裂解法基础上，对其

论文目录

• 独创性说明
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 染料的分类、结构与发色机理
• 1.1.1 染料的分类
• 1.1.2 染料结构与发色机理
• 1.2 偶氮染料的生产应用以及对环境的危害
• 1.2.1 我国现阶段染料生产以及使用状况
• 1.2.2 偶氮染料的其他应用方式
• 1.2.3 偶氮染料的危害以及对策
• 1.2.4 各国对于偶氮染料的相关政策
• 1.3 含偶氮染料废水的处理方法
• 1.3.1 物理吸附法
• 1.3.2 化学法
• 1.3.3 生物法
• 1.3.4 环境因素对偶氮染料生物脱色的影响
• 1.3.5 偶氮染料厌氧脱色机理以及偶氮还原酶
• 1.3.6 编码偶氮还原酶基因的克隆与表达
• 1.3.7 本实验室前期对偶氮还原酶的研究进展
• 1.4 红假单胞菌属在污染治理中的应用
• 1.4.1 球形红细菌（Rhodobacter sphaeroides）
• 1.4.2 部分污水处理应用研究
• 1.4.3 产氢及其与污水处理的结合
• 1.4.4 产氢机理以及抑制因素
• 1.5 基因工程菌
• 1.5.1 基因工程菌概述
• 1.5.2 基因工程菌在环境领域的应用
• 1.5.3 基因工程应用实例
• 1.5.4 基因工程菌的稳定性
• 1.5.5 基因工程菌的安全问题
• 1.6 本论文研究内容及意义
• 1.6.1 前期工作有待解决的问题及工程菌构建的提出
• 1.6.2 受体菌、穿梭载体的确定
• 1.6.3 本文的研究目的
• 1.6.4 本文的研究内容
• 2 球形红细菌及其胞内粗酶对模拟染料废水的脱色研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 培养基的配制及接种方法
• 2.1.3 菌体生长及染料吸光度和脱色率的测定
• 2.1.4 偶氮还原酶粗酶的提取
• 2.1.5 Red Sepharose CL-6B凝胶纯化粗酶
• 2.1.6 偶氮还原酶的凝胶电泳
• 2.1.7 蛋白含量测定
• 2.1.8 酶活分析体系
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 球形红细菌对偶氮染料的脱色
• 2.2.2 粗酶的提取和简单纯化
• 2.2.3 温度对酶活的影响
• 2.2.4 pH对酶活的影响
• 2.3.5 粗酶动力学
• 2.3 本章小结
• 3 沼泽红假单胞菌对模拟染料废水的脱色研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.3 菌体生长及染料吸光度和脱色率的测定
• 3.1.3 阴离子表面活性剂测定方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 菌体在染料废水中的生长、脱色情况
• 3.2.2 阴离子表面活性剂对该菌影响
• 3.3 本章小结
• 4 沼泽红假单胞菌野生质粒的提取与鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种来源
• 4.1.2 实验仪器与试剂
• 4.1.3 沼泽红假单胞菌质粒提取方法
• 4.1.4 引物合成、反向PCR及质粒测序
• 4.1.5 Genbank序列号
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 Rhodopseudomonas palustris AS1.2352质粒提取方法的改进
• 4.2.2 Rhodopseudomonas palustris AS1.2352野生质粒的提取和鉴定
• 4.3 本章小结
• 5 表达偶氮还原酶穿梭质粒的构建
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 基本实验操作
• 5.1.3 穿梭克隆载体的获取以及保存
• 5.1.4 目的基因片段的构建
• 5.1.5 载体的鉴定与定点突变
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 穿梭质粒构建路线
• 5.2.2 插入片段的设计与获取
• 5.2.3 穿梭克隆载体的获取以及保存
• 5.2.4 穿梭表达质粒的构建
• 5.2.5 质粒鉴定
• 5.2.6 定点突变
• 5.3 本章小结
• 6 偶氮染料降解基因工程菌的构建及其对模拟染料废水的脱色研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验方法
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 基因工程菌的构建：导入质粒载体
• 6.2.2 染料浓度对工程菌生长与脱色的影响
• 6.2.3 pH对工程菌生长与脱色的影响
• 6.2.4 温度对工程菌生长与脱色的影响
• 6.2.5 SDS对工程菌生长与脱色的影响
• 6.2.6 工程菌胞内粗酶的偶氮还原酶活性
• 6.3 本章小节
• 7 结论与展望
• 7.1 主要结论
• 7.2 本论文的创新之处
• 7.3 有待进一步研究的内容
• 参考文献
• 创新点摘要
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 附录A Rhodopseudomonas palustris野生质粒pRPSZY测序图
• 附录B Rhodopseudomonas palustris野生质粒pRPSZY登陆GeneBank
• 附录C Rhodobacter sphaeroides偶氮还原酶基因
• 附录D 沼泽红假单胞菌cbbM基因的核苷酸序列及编码的氨基酸序列
• 致谢
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