水稻EREBP型转录因子基因OsBIERFs和F-box蛋白基因OsHIHN-n11的克隆鉴定与功能分析

论文题目: 水稻EREBP型转录因子基因OsBIERFs和F-box蛋白基因OsHIHN-n11的克隆鉴定与功能分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 曹亦菲

导师: 郑重,宋凤鸣

关键词: 水稻,诱导抗病性,苯并噬二唑,稻瘟菌,蛋白,抗病反应,蛋白,抗病性,抗盐性

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本实验室在前期研究中,证明了苯并噻二唑(benzothiadiazole,BTH)能诱导水稻对稻瘟病、白叶枯病和纹枯病等病害的系统抗病性,并在此基础上运用抑制性差减杂交法分离鉴定了200多个与水稻抗病反应相关的差异表达cDNA。同源性搜索发现,其中一个差异表达片段BIHI-n2与已知植物EREBP型转录因子具有相似性。为探讨这个可能的ERF基因的生物学功能以及在水稻抗病性中的作用,本研究通过5’RACE和3’RACE,克隆得到了这个基因的全长cDNA序列,命名为OsBIERF1。此外运用生物信息学的方法,在水稻中得到另外三个ERF基因的全长cDNA序列,命名为OsBIERF2～4。在这些与水稻抗病反应相关的差异表达cDNA中,克隆BIHI-n2含有567 bp的插入片段,根据其序列设计基因特异性引物,分别与载体通用引物配对,从水稻cDNA文库中通过PCR扩增到基因的5’端和3’端序列,测序并拼接得到全长为1613bp的cDNA序列OsBIERF1,其中包含一个1200bp的(ORF)。该基因编码一个含399氨基酸的蛋白,并含有一个保守的ERF结构域。OsBIERF2～4这三个基因的克隆则运用了生物信息学及电子克隆的方法。首先在水稻基因组数据库中搜索与OsBIERF1 cDNA相似的序列,得到了一些可能的ERF基因序列片段。将这些预测的ERF cDNA序列片段在水稻ESTs库中进行搜索,然后将搜索得到的片段进行组装,得到完整的ERF基因序列。再设计特异性引物,也以水稻cDNA文库为模板,PCR扩增到OsBIERF2～4的全长cDNA序列。其大小分别为1116bp、1199bp和1214bp,并各自包含大小为708bp、912bp和987bp的开放阅读框,分别编码235、303和328氨基酸的蛋白。证明其编码的蛋白序列也都包含保守的ERF结构域。进一步分析发现,这四个基因都以单拷贝形式分别存在于水稻第9,1,2和3号染色体上。序列比对及系统树分析发现,OsBIERF1-4属于ERF蛋白家族中不同的亚组。OsBIERF3属于第Ⅰ亚组,OsBIERF2属于第Ⅱ亚组,OsBIERF1和OsBIERF4则被归为第Ⅳ亚组。将OsBIERF3的编码区ORF克隆进原核表达载体,纯化获得重组的OsBIERF3融合蛋白。凝胶阻滞实验的结果表明,重组OsBIERF3融合蛋白能够

论文目录:

致谢

摘要

ABSTRACT

第一章文献综述与研究背景：

1.1 植物抗病信号传导途径

1.1.1 由R基因介导的信号传导途径

1.1.2 依赖于水杨酸的抗性途径

1.1.3 信号传导途径之间的交流与互作

1.2 植物转录因子

1.2.1 转录因子的结构与功能

1.2.2 与植物抗病反应有关的转录因子

1.2.3 顺式作用元件

1.2.4 植物转录因子的活性调节

1.3 泛素介导的蛋白水解系统

1.3.1 F-box结构域、F-box蛋白及其识别目标底物蛋白机

1.3.2 F-box蛋白的功能

1.4 本研究的目的意义和主要研究内容

1.4.1 选题依据及研究的目的和意义

1.4.2 主要研究内容

第二章 EREBP型转录因子OSBIERF1-4的克隆鉴定及功能分析

摘要

2.1 前言

2.2.材料与方法

2.2.1 水稻幼苗的培育与处理

2.2.2 OsBIERF1-4 cDNA基因的克隆

2.2.3 DNA测序和序列分析

2.2.4 OsBIERF3融合蛋白的原核表达及体外DNA结合活性分析

2.2.5 pSGFP-OsBIERF3蛋白的核定位分析

2.2.6 Northern杂交分析

2.2.7 转化烟草的材料

2.2.8 植物转化双元表达载体CHF3-OsBIERF3的构建

2.2.9 烟草叶盘转化与卡那抗性植株的再生

2.2.10 转基因烟草的分子鉴定

2.2.11 转基因烟草植株PR-1a基因的表达分析

2.2.12 转OsBIERF3基因烟草T1代抗病性测定

2.2.13 转OsBIERF3基因烟草T1代抗盐性测定

2.3 结果与分析

2.3.1 OsBIERF1～4四个基因的克隆

2.3.2 OsBIERF1～4蛋白分属于ERF家族中不同的亚组

2.3.3 OsBIERF3蛋白的DNA结合活性

2.3.4 OsBIERF3蛋白定位于植物细胞核内

2.3.5 OsBIERF基因在水稻抗病反应中的差异表达

2.3.6 OsBIERF基因被各种非生物胁迫诱导表达

2.3.7 植物双元表达载体CHF_3-OsBIERF3的构建

2.3.8 转OsBIERF3基因烟草植株的获得

2.3.9 转OsBIERF3基因烟草植株的分子鉴定

2.3.10 转OsBIERF3基因T1代烟草植株提高了对不同病原菌的抗病性

2.3.11 转OsBIERF3基因T1代烟草植株提高了抗盐性

2.4 讨论

第三章水稻OSHIHN-N11基因全长CDNA的克隆鉴定

摘要

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 供试水稻、病菌菌株、诱导处理及病菌接种(同第二章2.2.1)

3.2.2 水稻OsHIHN-n11基因cDNA序列的克隆

3.2.3 水稻OsHIHN-n11基因cDNA序列的测序及序列分析(同第二章2.2.3)

3.2.4 Southern杂交

3.2.5 Northern杂交

3.2.6 OsHIHN-n11植物双元表达载体的构建

3.2.7 根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化

3.2.8 烟草基因组DNA的提取

3.2.9 转基因烟草植株的PCR检测

3.2.10 转基因烟草中PR-1a和sar8.2基因的表达分析

3.2.11 转OsHIHN-n11基因烟草T1代抗病性测定

3.2.12 转OsHIHN-n11基因烟草T1代ABA处理

3.3 结果与分析

3.3.1 OsHIHN-n11基因全长cDNA序列的克隆及序列分析

3.3.2 OsHIHN-n11基因在水稻抗病反应中的差异表达

3.3.3 过量表达OsHIHN-n11的转基因烟草的获得与鉴定

3.3.4 OsHIHN-n11转基因烟草中PR-1a和Sar8.2的表达

3.3.5 转OsHIHN-n11基因T1代烟草植株的抗病性分析

3.3.6 过量表达OsHIHN-n11的转基因烟草对ABA敏感性变化

3.4 讨论

全文总结和今后研究

参考文献

发布时间: 2005-07-22

参考文献

[1].水稻长叶毛基因Hairy Leaf 6的图位克隆与功能分析[D]. 孙文强.华中农业大学2017
[2].水稻CCT家族基因的功能研究和Hd1的重新克隆[D]. 章佳.华中农业大学2017
[3].miR396调控水稻产量的分子机理研究[D]. 高峰.武汉大学2015
[4].fsv1水稻胚珠发育过程中基因表达及不育机理研究[D]. 杨丽玉.武汉大学2016
[5].水稻OsSEC18和OsVPS37基因的功能研究[D]. 孙允芳.武汉大学2013
[6].GWAS定位水稻苗期耐冷基因和抗白叶枯基因[D]. 王丹.湖南农业大学2017
[7].两个水稻叶形基因的精细定位及遗传分析[D]. 张小惠.四川农业大学2016
[8].不同水稻品种对氮素响应的差异及其农艺生理性状[D]. 剧成欣.扬州大学2017
[9].水稻穗颈伸长基因EUI2（t）的精细定位与克隆[D]. 朱宏波.福建农林大学2003
[10].分子标记辅助选择技术在水稻抗病育种中的应用[D]. 陈志伟.福建农林大学2004

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