致病性迟缓爱德华氏菌的鉴定、PCR检测及esaC基因的功能鉴定

论文摘要

迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是一种革兰氏阴性肠道菌,感染宿主范围广。由该菌引起的爱德华氏菌病是水产养殖最常见的传染病之一,给水产业造成巨大的经济损失。本研究从发病大菱鲆分离和鉴定了2株迟缓爱德华氏菌,建立了致病性迟缓爱德华氏菌的PCR检测方法,对esaC基因的功能进行了鉴定,构建了迟缓爱德华氏菌的三个基因缺失突变株并进行初步鉴定,为将来用于筛选减毒活疫苗打下基础。主要结果如下:一、迟缓爱德华氏菌的分离鉴定:从两个养鱼场的发病大菱鲆分离得到了2株优势菌JN和MHK2。人工感染大菱鲆实验表明JN和MHK2对鱼的半数致死浓度(LD50)分别为2.51×104cfu/fish和6.30×103 cfu/fish。对JN和MHK2的16s rDNA序列分析表明,它们与迟缓爱德华氏菌的序列相似性为99%。API ID32E生理生化检测表明,它们与标准迟缓爱德华氏菌的各项反应指标高度一致。因此将JN和MHK2鉴定为迟缓爱德华氏菌。二、致病性迟缓爱德华氏菌的PCR检测:以迟缓爱德华氏菌的主要毒力因子—III型分泌系统（T3SS）的装置蛋白基因esaV、过氧化氢酶基因katB为靶基因,设计特异性引物用于迟缓爱德华氏菌PCR检测。结果表明,在11株致病性菌中都检测到了esaV和katB基因的存在;在13株非致病性菌株中均没有检测到esaV基因,有4株检测到katB基因。根据上述结果,esaV基因可以作为区分致病性和非致病性迟缓爱德华氏菌的一个分子标记。三、esaC基因的功能鉴定:迟缓爱德华氏菌T3SS的1个装置蛋白。本研究采取基因缺失突变技术,构建了esaC基因缺失突变株。Westernblotting分析表明,由于esaC基因的缺失,迟缓爱德华氏菌T3SS的输送器蛋白（EseB,EseC,EseD）虽然可以正常的表达,但是不能分泌到细胞外,同时细菌的自凝聚现象消失。毒力检测发现,突变株对蓝曼龙鱼的半数致死浓度(LD50)比野生型菌株提高了10倍。结果表明,esaC基因影响迟缓爱德华氏菌的毒力和T3SS相关蛋白的分泌。本研究进一步确定了esaC基因作为迟缓爱德华氏菌T3SS装置蛋白的功能,加深了对迟缓爱德华氏菌致病机理的了解。四、三基因缺失突变株的构建和初步鉴定:利用基因缺失突变技术,构建了迟缓爱德华T3SS基因esrB、T6SS（VI型分泌系统）基因evpH、芳香族氨基酸合成酶基因aroA的三基因缺失突变株。人工感染实验表明,该突变株的毒力大大下降,LD50>108cfu/ml。细菌在鱼体内存活实验表明,该突变株细菌在牙鲆鱼体内的存活时间不超过18天,在21天可检测到牙鲆血清产生凝集抗体。结果表明,该迟缓爱德华氏菌的三基因突变株作为减毒细菌,可用于下一步的减毒疫苗筛选和鉴定工作。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第一节 细菌性病原的鉴定和检测
• 引言
• 1 传统的经典细菌鉴定
• 1.1 形态学鉴定
• 1.2 生理生化鉴定
• 1.3 快速细菌鉴定方法
• 2 分子生物学检测方法
• 2.1 PCR检测方法
• 2.2 免疫检测技术
• 第二节 迟缓爱德华氏菌的研究进展
• 引言
• 1 迟缓爱德华氏菌分类地位及分布特征
• 2 迟缓爱德华氏菌的致病机制
• 2.1 黏附和入侵
• 2.2 抗免疫杀伤机制
• 2.3 细胞毒素和胞外酶
• 2.4 细菌分泌系统
• 3 迟缓爱德华氏菌的防治
• 3.1 化学治疗法
• 3.2 免疫治疗防治法
• 第二章 致病性迟缓爱德华氏菌的分离、鉴定和检测
• 第一节 养殖大菱鲆致病性迟缓爱德华氏菌的分离和鉴定
• 引言
• 1、材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂和溶液
• 1.3 培养基
• 1.4 试剂盒与试剂条
• 1.5 仪器
• 50测定'>1.6 LD₅₀测定
• 1.7 16srRNA基因的克隆和序列分析
• 1.8 APIID32E试剂条生理生化鉴定
• 1.9 API ZYM酶活检测
• 2 结果与分析
• 2的对大菱鲆的半数致死量(LD₅₀)'>2.1 JN、MHK₂的对大菱鲆的半数致死量(LD₅₀)
• 2 的16s rDNA 分子鉴定'>2.2 JN、MHK₂ 的16s rDNA 分子鉴定
• 2.3 API ID32E 生化鉴定
• 2.4 API ZYM 酶活检测
• 3 讨论
• 第二节 PCR检测致病性迟缓爱德华氏菌
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 引物设计
• 1.2 迟缓爱德华氏菌株
• 1.3 实验方法
• 2 结果与讨论
• 第三章 迟缓爱德华氏菌esaC基因缺失株的构建和鉴定
• 引言
• 1、材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂和溶液
• 1.3 仪器
• 1.4 引物设计
• 1.5 迟缓爱德华氏菌esaC 基因缺失突变株的构建
• 1.6 迟缓爱德华氏菌胞外蛋白诱导表达和提取
• 1.7 迟缓爱德华氏菌胞外蛋白和总蛋白的检测
• 1.8 自凝集现象
• 50)的测定'>1.9 突变株半数致死剂量(LD₅₀)的测定
• 2 结果和分析
• 2.1 迟缓爱德华氏菌esaC 基因缺失片断的构建
• 2.2 westernblotting
• 2.3 自凝集现象
• 50)'>2.4 突变株半数致死量(LD₅₀)
• 3 讨论和分析
• 第四章 迟缓爱德华氏菌多基因缺失突变株的构建
• 前言
• 1、材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 esrB、evpH基因双缺失突变株的构建
• 1.3 aroA、esrB、evpH基因三缺失突变株的构建
• 1.4 突变株检测引物的设计
• 1.5 半数致死量的测定
• 1.6 细菌在鱼体内存活时间的测定
• 1.7 减毒株是否具有免疫效果的初步检测
• 2、实验结果
• 2.1 基因缺失株的构建
• 2.2 半数致死浓度的测定
• 2.3 细菌在鱼体内存活时间的初步检测
• 2.4 减毒株免疫效果的初步测定
• 3、讨论
• 参考文献
• 个人简历
• 参与和发表文章
• 致谢