彭泽鲫抗菌肽基因的筛选及其分析鉴定

论文摘要

近年来,淡水养殖业经常爆发大规模感染性疾病,导致严重经济损失,而由于全世界食品安全法规对食品中抗生素残余的要求越来越严格,严重限制了抗生素在治疗鱼病时的应用。抗菌肽被证明是鱼类非特异性免疫系统的重要组成部分,可用于对抗感染性疾病,被当做是抗生素的良好替代品。彭泽鲫是我国第一个直接从野生鲫鱼中人工选育出的养殖新品种,它具有培育简单、生长快、营养价值高、抗逆性强等许多优良特性,是一种重要的经济淡水鱼类,本试验拟从彭泽鲫体内筛选新型抗菌肽基因,从而为开发新型抗菌药物奠定基础。本试验以成年彭泽鲫为材料,将其分为两组:实验组（T组）和健康对照组（C组）,实验组彭泽鲫用灭活的嗜水气单胞菌进行腹腔注射处理。采用3个锚定引物和8个随机引物共24个组合的逆转录PCR反应对T组和C组肝脏总RNA进行差异显示逆转录PCR（DDRT-PCR）分析,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染技术分离DDRT-PCR产物,获得T组特异的差异显示条带31条。经PCR再扩增、电泳检测和纯化,共得到差异显示的cDNA片段20条。将此20条差异显示的cDNA片段进行T-A克隆和测序后,获得11个差异显示ESTs序列。这些序列已递交给GenBank的dbEST数据库,登录号为:GE342614,GE342615,GE342616,GE342617,GE653346,GE653347,GE653348,GE653349,GH159107,GH159108,GH159709。通过BLASTn和BLASTx工具将这些差异显示ESTs与GenBank数据库进行比对,发现一些与它们同源的序列,这些同源序列的功能注释可为确定差异显示ESTs所属基因的功能提供一定的参考。然而,我们获得的大部分差异显示ESTs的功能目前尚未报道,它们可能是彭泽鲫中存在的新的抗菌肽基因序列。本试验结果为进一步研究致病菌诱导下彭泽鲫体内免疫相关基因,尤其是抗菌肽基因的表达情况提供了重要信息,为发现鱼类新型抗菌肽基因奠定了基础,但各差异显示ESTs、其所代表的基因尚需在结构、功能方面做进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 鱼类抗菌肽研究进展
• 1.1.1 鱼类抗菌肽的生化特点与组成
• 1.1.2 鱼类抗菌肽基因的结构
• 1.1.3 鱼类抗菌肽的生物学活性与功能
• 1.1.4 鱼类抗菌肽的抗菌机制
• 1.1.5 展望
• 1.2 基因表达差异的研究方法
• 1.2.1 前言
• 1.2.2 基因表达差异的研究方法
• 1.2.3 mRNA差异显示技术的应用
• 1.2.4 小结
• 1.3 表达序列标签的研究及应用
• 1.3.1 前言
• 1.3.2 表达序列标签的研究及应用
• 1.3.3 小结
• 1.4 本试验的研究意义和主要内容
• 第2章 彭泽鲫肝脏差异显示cDNA片段的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 Trizol法提取彭泽鲫肝脏总RNA及其纯化
• 2.1.3 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性
• 2.1.4 总RNA中基因组DNA的酶解
• 2.1.5 逆转录（1st Strand cDNA合成）
• 2.1.6 差异显示逆转录PCR（DDRT-PCR）
• 2.1.7 8M-尿素-6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.1.8 银染法染色
• 2.1.9 差异片段的切取、再扩增与纯化
• 2.2 试验结果
• 2.2.1 彭泽鲫肝脏组织总RNA的提取与纯化
• 2.2.3 差异片段的切取
• 2.2.4 差异片段的再扩增、回收与纯化
• 2.3 讨论与分析
• 2.3.1 总RNA的提取
• 2.3.2 关于DNaseI的处理
• 2.3.3 反应条件对实验结果的影响
• 2.3.4 差异片段的回收与再扩增
• 2.4 小结
• 第3章 差异显示cDNA片段的克隆与测序
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 差异显示cDNA片段的克隆
• 3.1.3 转化子的筛选
• 3.1.4 质粒DNA提取及纯化
• 3.1.5 序列测定
• 3.1.6 确定差异显示cDNA片段序列
• 3.2 试验结果
• 3.2.1 阳性片段的克隆与筛选
• 3.2.2 菌落PCR验证结果
• 3.2.3 质粒提取与鉴定
• 3.2.4 阳性克隆的序列测定
• 3.2.5 差异显示cDNA片段的序列信息
• 3.3 讨论与分析
• 3.3.1 PCR产物与载体的连接与克隆效率
• 3.3.2 关于测序结果
• 3.4 小结
• 第4章 彭泽鲫肝脏差异显示ESTs的分析鉴定
• 4.1 分析方法
• 4.2 分析结果
• 4.2.1 序列递交结果
• 4.2.2 相似性搜索结果
• 4.3 讨论与分析
• 4.3.1 搜索结果中存在功能注释的差异显示ESTs
• 4.3.2 搜索结果中不存在功能注释的差异显示ESTs
• 4.3.3 未来的研究方向
• 4.4 小结
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果