水稻MYB家族转录因子OsMYB2的功能研究

论文摘要

转录调控是植物生长发育、逆境反应、信号转导、抗病性等一系列基因表达的最主要调控形式,转录因子是参与基因转录水平调控过程的重要因子。MYB转录因子是植物转录因子中最大的家族之一,可以特异的识别结合基因启动子中的MYB顺式作用元件,调控与生物或非生物逆境相关的一系列基因表达。本研究对水稻转录因子OsMYB2进行研究,对OsMYB2 cDNA的氨基酸序列与其他植物中已知的MYB家族的蛋白进行对比,结果表明该转录因子具有一个非常保守的R2R3MYB结构域。序列分析显示OsMYB2在N端保守域包含两个不完全的色氨酸重复,色氨酸重复区域形成螺旋-转角-螺旋的DNA结合域,还含有一个潜在的ATP-GTP结合位点,一个对氧化还原反应敏感的半胱氨酸,和一个核定位序列。对水稻进行各种逆境处理和提取不同组织的RNA,将其反转录为cDNA进行RT-PCR分析。结果是OsMYB2受干旱（PEG）、盐（200mM NaCl）和ABA（200μM）处理诱导,但不受低温诱导。组织表达特异性检测表明,OsMYB2在根、茎、叶、开花期穗、灌浆期穗均有表达,但是在根中的转录水平最高。为了深入了解所克隆的水稻OsMYB2基因的生理功能及与非生物逆境应答的关系,构建了OsMYB2基因的植物表达载体,通过农杆菌蘸花法转化拟南芥,经潮霉素筛选、GUS活性检测和PCR检测验证筛选到转基因阳性植株。生理功能分析表明,与野生型相比,转基因株系对ABA表现出超敏,对逆境的反应表现更弱,但是对糖的反应表现更强。同时,对OsMYB2可能调控的下游基因进行了表达谱分析,结果是RD22和RD29A的表达被下调,而ADH的表达被上调。MYB转录因子能特异的与MYB顺式元件相结合。本文选择SV40的增强子中的一段MYB顺式元件TAACTG来构建酵母鱼饵质粒,利用酵母单杂交方法,对OsMYB2识别结合MYB元件的特异性进行了研究。结果表明,OsMYB2与MYB元件能特异结合,且结合后导致下游报告基因表达量减少,推测此基因为转录抑制子,在基因表达中起负调控的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略语说明
• 第一章 文献综述
• 1 植物转录因子的研究
• 1.1 转录因子
• 1.2 转录因子的分类
• 1.3 植物转录因子的结构
• 1.4 转录因子的活性调控
• 1.5 植物转录因子功能分析方法
• 2 MYB 转录因子家族的特征、分类和功能
• 2.1 什么是MYB 蛋白
• 2.2 MYB 蛋白的进化
• 2.3 植物MYB 蛋白的功能多样性
• 2.3.1 参与植物苯丙烷类次生代谢的调节
• 2.3.2 参与细胞分化、形态建成的发育调控
• 2.3.3 参与植物对激素的应答
• 2.3.4 参与植物的生物和非生物抗性
• 2.3.5 作为一种端粒结合蛋白对染色体起保护作用
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 水稻转录因子OsMYB2的序列及表达模式分析
• 前言
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 化学试剂和酶制剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 植物材料处理
• 1.2.2 DNA 序列和数据分析
• 1.2.3 水稻总 RNA 的抽提及cDNA 合成
• 1.2.4 荧光定量PCR 分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 OsMYB2的序列分析
• 2.2 OsMY82 基因在不同逆境条件下以及在不同组织中的表达
• 3. 讨论
• 第三章 水稻转录因子OsMYB2基因的功能
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 细菌菌株和质粒
• 1.1.3 化学试剂和酶制剂
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 测序
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 电击法转化农杆菌
• 1.2.2 拟南芥转化
• 1.2.2.1 拟南芥的培养
• 1.2.2.2 农杆菌的准备
• 1.2.2.3 拟南芥蘸花法转化
• 1.2.2.4 拟南芥种子的筛选
• 1.2.2.5 GUS 组织化学染色分析
• 1.2.3 转基因阳性植株的 PCR 检测
• 1.2.3.1 拟南芥总DNA 的提取
• 1.2.3.2 拟南芥基因组 DNA 去除与cDNA 合成
• 1.2.3.3 PCR 检测
• 1.2.4 拟南芥转基因植株的生理分析实验
• 1.2.5 荧光定量PCR 分析
• 2 结果与分析
• 2.1 OsMYB2基因转化拟南芥及阳性植株的鉴定
• 2.2 转OsMYB2基因拟南芥的生理功能分析
• 2.2.1 转基因拟南芥的表型分析
• 2.2.2 OsMYB2对ABA超敏
• 2.2.3 OsMYB2对盐胁迫的反应
• 2.2.4 OsMYB2对重金属的反应
• 2.2.5 OsMYB2对糖的反应
• 2.2.6 不同处理前后下游基因的检测
• 3 讨论
• 第四章 水稻转录因子OsMYB2与顺式元件特异性结合能力
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 酵母菌株和质粒
• 1.1.2 化学试剂和酶制剂
• 1.1.3 PCR 引物
• 1.1.4 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 DNA 操作
• 1.2.2 酵母感受态细胞的制备和质粒的转化
• 1.2.3 β-半乳糖苷酶的酶活检测
• 2 结果与分析
• 2.1 有关植物 MYB 顺式调控元件的合成
• 2.2 具有MYB3cis的鱼饵质粒构建
• 2.3 构建OsMYB2基因与pPC86的融合表达载体
• 2.4 酵母体内结合实验
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢