哈茨木霉rac基因的敲除

论文摘要

哈茨木霉是一种重要的生物防治真菌,能拮抗多种植物病原菌如立枯丝核菌、齐整小核菌、尖孢镰孢菌、烟草疫霉等。在哈茨木霉拮抗病原菌的过程中病原菌会产生物理或化学信号分子。这些信号分子与哈茨木霉上相应的信号分子受体结合使哈茨木霉上的受体激活。活化的受体会启动哈茨木霉细胞内多种信号传导途径从而使木霉发生一系列细胞功能的改变。小G蛋白耦联受体介导的信号转导是一种重要的信号转导途径。rac基因编码的RAC蛋白是小G蛋白超家族中Rho家族的成员。rac基因的功能在哺乳细胞中研究较深入但在丝状真菌中的研究相对较少。对该基因的深入研究有助于揭示木霉拮病原菌的分子机制,并为阐明哈茨木霉中小G蛋白耦联受体介导的信号转导通路奠定基础。本实验以与哈茨木霉亲缘关较近的绿木霉为模板,通过设计一系列半随机引物的方法成功获得了哈茨木霉rac基因编码区及其上下游的DNA序列共2741bp。其中哈茨木霉rac基因编码区上游序列782bp,rac基因编码区990bp,rac基因编码区下游序列969bp。比较哈茨木霉rac基因完整编码区DNA序列与该基因的cDNA序列发现该基因编码区含有五个内含子,且五个内含子均以GT起始以AG结尾。将rac基因编码区DNA序列与全基因组测序的绿木霉,深绿木霉,里氏木霉DNA序列进行序列比对发现该基因编码区的DNA序列与绿木霉部分DNA序列相似性最高。根据获得的rac基因编码区及其侧翼序列选择恰当的酶切位点构建了两种可以敲除哈茨木霉rac基因的质粒载体pPZPTtk8.10::rac::hyg1和pPZPTtk8.10::rac::hyg2。酶切鉴定结果和质粒测序结果都说明两种敲除质粒载体构建成功。利用根癌农杆菌介导的哈茨木霉遗传转化方法获得了一系列哈茨木霉转化子。通过正筛选和负筛选双重筛选,获得了敲除了rac基因的哈茨木霉突变菌株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景及研究的目的和意义
• 1.2 哈茨木霉对植物病害生物防治的研究概况
• 1.3 小G 蛋白的研究概况
• 1.3.1 小G 蛋白的基本结构
• 1.3.2 小G 蛋白的分子开关功能
• 1.3.3 小G 蛋白的细胞定位
• 1.3.4 小G 蛋白Rac 功能研究进展
• 1.4 基因敲除技术
• 1.5 本文的主要研究内容
• 第2章 材料及方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株和质粒载体
• 2.1.2 实验所用酶与试剂
• 2.1.3 配制的溶液
• 2.1.4 实验所用培养基
• 2.1.5 实验所用引物
• 2.1.6 实验所用仪器设备
• 2.1.7 实验所用的生物学软件
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 菌种的ITS 序列鉴定
• 2.2.2 哈茨木霉rac 基因编码区 DNA 序列的获得
• 2.2.3 哈茨木霉rac 基因编码区侧翼序列的获得
• 2.2.4 哈茨木霉rac 基因敲除质粒载体的构建
• 2.2.5 根癌农杆菌的电击转化
• 2.2.6 根癌农杆菌介导的哈茨木霉的遗传转化
• 2.2.7 哈茨木霉转化子的筛选与鉴定
• 第3章 哈茨木霉rac 基因编码区及其侧翼序列的获得
• 3.1 引言
• 3.2 菌种ITS 序列鉴定
• 3.3 哈茨木霉rac 基因编码区序列的获得
• 3.4 哈茨木霉rac 基因编码区侧翼序列的获得
• 3.5 讨论
• 3.5.1 哈茨木霉 ITS 序列鉴定
• 3.5.2 设计引物的非特异性
• 3.5.3 测序结果误差分析
• 3.6 本章小结
• 第4章 两种哈茨木霉rac 基因敲除载体的构建
• 4.1 引言
• 4.2 中间载体pUC18::rac 的构建
• 4.3 中间载体pUC18:rac:hy911 与pUC18:rac:hyg12 的构建
• 4.4 哈茨木霉rac 基因敲除质粒载体的构建
• 4.5 讨论
• 4.5.1 质粒pUC18::rac 经 HindⅢ酶切结果讨论
• 4.5.2 构建敲除质粒载体过程中遇到的问题与解决方法
• 4.5.3 两种敲除质粒载体的比较
• 4.6 本章小结
• 第5章哈茨木霉遗传转化及敲除转化子的筛选与鉴定
• 5.1 引言
• 5.2 根癌农杆菌的电击转化
• 5.3 潮霉素筛选浓度的确定
• 5.4 根癌农杆菌AGL-1 与EHA105 介导的哈茨木霉的遗传转化
• 5.5 5-氟-2'-脱氧-尿苷筛选浓度的确定
• 5.6 敲除转化子的筛选与鉴定
• 5.7 讨论
• 5.7.1 质粒载体在不同菌中拷贝数差异讨论
• 5.7.2 提高哈茨木霉转化效率的方法
• 5.7.3 哈茨木霉rac 基因敲除转化子的筛选原理
• 5.8 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文及其他成果
• 致谢