论文摘要
RUNX3、DAPK基因甲基化与胃癌关系的研究前言目前的研究发现，胃癌中许多肿瘤抑制基因和肿瘤相关基因的失活是由于基因启动子区的异常甲基化引起的。RUNX3蛋白是TGF-β超家族信号传导通路下游的一个转录因子，介导TGF-β生长抑制的功能，在哺乳动物的发育及组织分化过程中发挥重要作用，胃癌中，RUNX3基因功能缺失严重，但突变率很低，提示存在其他的失活方式。DAPK蛋白是负责启动细胞凋亡的一种蛋白激酶，广泛存在于各种细胞凋亡系统中，在凋亡过程的初期就被激活，活性持续到细胞发生不可逆的自毁为止，对防止肿瘤的发生及遏制肿瘤的发展具有重要意义。本研究采用MSP法检测了胃癌原发灶、癌旁正常组织及转移淋巴结中RUNX3与DAPK基因的甲基化状态，以期揭示这两个基因甲基化与胃癌发生、发展以及与胃癌临床病理特征的关系。实验方法标本来源：收集2005年2月至2005年8月间中国医科大学附属第一医院肿瘤外科38例手术切除的胃癌组织，相应的癌旁正常组织和转移淋巴结。所取组织离体后立即一分为二，一份置-70℃冰箱中保存。另一份制作常规病理切片，HE染色，确定病理诊断。所有胃癌患者术前均未行化疗或放疗，男性26例，女性12例，年龄为36～80岁，中位年龄57岁。所有癌旁组织经病理检查未发现肿瘤细胞，所取淋巴结组织经病理证实存在癌细胞。正常对照标本取自无消化系统疾病及任意肿瘤的正常人外周血。方法：常规酚／氯仿抽提法提取DNA，取4μgDNA，去离子水稀释至90μl，按文献方法进行DNA预处理，之后用Wizard DNA Clean-up System纯化，方法按说明书操作。用50μL TE溶解DNA，采用MSP法扩增预处理后的DNA模本，同时扩增甲基化酶SssⅠ修饰和未修饰的正常人外周血DNA作为甲基化阳性和非甲基化阳性对照，以去离子水替代DNA模本作为阴性对照。冰上配制PCR反应体系，于PCR仪中扩增。结果判定：取5μ1 PCR产物在2.5％琼脂糖凝胶上电泳，GeneFinder染料染色，成像仪观察并摄像。获得甲基化产物即可判定为甲基化阳性；得到非甲基化产物，且无甲基化产物判定该例标本为非甲基化；既未获得甲基化产物也未获得非甲基化产物则标志本次实验失败。统计学分析：采用SPSS13.0软件进行Fisher’s精确检验，P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果1、癌旁正常组织中RUNX3、DAPK基因甲基化情况：RUNX3基因甲基化率为21.1％，DAPK基因甲基化率为42.1％，该基因甲基化与年龄相关，随着年龄的增长，胃粘膜组织发生甲基化的机率显著增高（P＜0.05）。RUNX3、DAPK基因甲基化率均显著低于胃癌组织和转移淋巴结中相应的基因甲基化率（均P＜0.01）。2、胃癌组织中RUNX3、DAPK基因甲基化情况：94.7％（36／38）的胃癌组织至少存在一种基因的甲基化，60.5％（23／38）的胃癌组织中这两个基因均呈甲基化状态。其中，RUNX3基因的甲基化率为73.7％，并且该基因甲基化与癌灶大小相关，癌灶长径大于5cm者发生甲基化的几率显著高于长径不超过于5cm者（P＜0.05）。DAPK基因的甲基化率为81.6％。3、转移淋巴结中RUNX3、DAPK基因甲基化情况：RUNX3基因甲基化率为65.8％，38例转移淋巴结中，92.1％（35／38）的标本都得到了RUNX3非甲基化产物。DAPK基因甲基化率为70.2％。4、RUNX3、DAPK基因甲基化与其他胃癌临床病理特征的关系：基因甲基化与肿瘤TNM分期、大体类型、分化程度、浸润深度及生长方式等临床病理特征无关（均P＞0.05）。结论1、RUNX3、DAPK基因异常甲基化是胃癌发生发展过程中的频繁事件。随着年龄的增长，胃粘膜组织中DAPK基因发生甲基化的几率增加，这可能增加患胃癌的风险。而RUNX3基因甲基化将促进肿瘤的生长。2、通过检测胃粘膜组织及淋巴结中该基因的甲基化情况，可能会对胃癌的早期诊断及判断淋巴结的微转移提供一定的参考价值。逆转RUNX3、DAPK基因的高甲基化状态有可能成为预防胃癌发生，遏制胃癌发展的新疗法。