山核桃嫁接成活相关基因克隆

论文摘要

嫁接是一门园艺技术,其成活过程包含细胞脱分化、再分化等重大理论问题。山核桃嫁接是公认的难题,为了深入探索这一珍贵物种的嫁接分子机理和调控机制,本研究采用cDNA-AFLP技术和定量RT-PCR技术对山核桃嫁接成活相关基因进行筛选、分离和生物信息学分析,结果表明:1.利用改良的CTAB法提取的嫁接样品总RNA质量高、完整性好、无杂质,适用于cDNA-AFLP分析和荧光定量RT-PCR分析。2.利用SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit反转录获得的8个实验材料双链cDNA,完整性好,满足实验要求。3.用识别4碱基和6碱基的限制性内切酶TaqI、AseI消化cDNA,所得片段长度符合技术要求。酶切片段与人工接头连接后进行预扩,获得相当浓度的200～1000bp的酶切片段拷贝。4.选用100对选扩引物进行了选择性扩增。改进选扩程序,采用高温（65℃）退火结合循环降温方法,获得高浓度的特异性产物。5.用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染对选扩产物进行差异显示,结果共获得300多条差异表达片段。经切胶回收、纯化和二次克隆等所得差异片段100多条。共测回来的序列66条,经Blast比序,除去重复序列17条,结果获得了49条TDFs。6.选取其中12条基因进行定量RT-PCR验证分析,结果显示,其中八个克隆translational initiation factor eIF-4A,3’-5’-exoribonuclease/ RNA binding （AT2G47220）,18号未知基因,isolate K1/E32 K1 glycoprotein,putative auxin response factor 1,water channel （PIP1B）,Glycine max catalase （cat4）,65号未知基因与cDNA-AFLP的表达一致,一个克隆25号未知基因与cDNA-AFLP的表达基本一致,而其余三个克隆17号未知基因,beta family G-protein,cdc20 protein （CDC20.2）的表达与cDNA-AFLP的表达结果有差异。本实验cDNA-AFLP的表达谱中的75%得到验证。7.在49条TDFs中,有20个编码已知功能蛋白,8个编码未知功能蛋白,其余的21个与未注释的基因组序列相似,或者在核苷酸数据库无同源序列。对20个已知功能的基因进行功能分析,它们分属于物质运输,代谢和能量,细胞周期,信号转导等9类,说明山核桃嫁接过程中发生了复杂的代谢变化。根据所获得的差异表达基因,初步绘制了山核桃嫁接调控关系图,从分子水平上证实了现代嫁接的细胞生物学理论。本研究首次将cDNA-AFLP技术和定量RT-PCR分析技术应用于山核桃基因的差异表达研究,并对其加以改进,成功分离到山核桃嫁接成活相关基因。根据这些差异片段序列制作探针或转化成相应的分子标记,可以为嫁接成活基因的定位、克隆以及基因表达特性的研究提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 植物嫁接成活机理研究
• 1.1.1 嫁接形态解剖学机理
• 1.1.2 嫁接成活生理生化机理
• 1.1.2.1 水分
• 1.1.2.2 养分
• 1.1.2.3 激素
• 1.1.2.4 净光合速率（fn）
• 1.1.2.5 呼吸
• 1.1.3 嫁接成活分子机理
• 1.1.3.1 基因
• 1.1.3.2 蛋白质
• 1.1.4 植物嫁接的展望
• 1.2 CDNA-AFLP 技术原理及特点
• 1.2.1 cDNA-AFLP 技术原理
• 1.2.2 cDNA-AFLP 技术特点
• 1.2.2.1 重复性高，可检测低丰度表达的mRNA
• 1.2.2.2 可准确地反映基因间表达量的差异
• 1.2.2.3 全面获取转录组的表达信息
• 1.3 CDNA-AFLP 技术在植物上的应用
• 1.3.1 基因表达特性的研究
• 1.3.2 构建转录图谱
• 1.3.3 分离特异表达的基因
• 2 材料与方法
• 2.1 材料准备
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 试剂及来源
• 2.1.4 接头和引物序列
• 2.2 RNA 的提取及纯化
• 2.2.1 RNA 提取
• 2.2.2 总RNA 提取质量检测
• 2.2.3 mRNA 纯化
• 2.3 CDNA-AFLP
• 2.3.1 双链cDNA 的合成
• 2.3.1.1 第一链cDNA 合成
• 2.3.1.2 第二链cDNA 合成
• 2.3.1.3 用QIAquick PCR Purification Kit 纯化cDNA
• 2.3.2 cDNA 酶切连接
• 2.3.2.1 TaqI 酶切
• 2.3.2.2 AseI 酶切
• 2.3.2.3 连接
• 2.3.3 预扩增
• 2.3.4 选择性扩增
• 2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3.5.1 配制测序胶
• 2.3.5.2 测序胶电泳
• 2.3.5.3 测序胶银染
• 2.4 特异片段克隆测序
• 2.4.1 特异片段回收
• 2.4.2 扩增片段纯化
• 2.4.3 PCR 产物与T-Vector 的连接
• 2.4.4 感受态细胞制备（CaC12 法）
• 2.4.5 质粒转化
• 2.4.6 质粒提取并进行酶切检测
• 2.4.7 PCR 鉴定
• 2.4.8 序列测定
• 2.5 定量RT-PCR 方法
• 2.5.1 植物材料
• 2.5.2 RNA 提取
• 2.5.3 选择内参
• 2.5.4 定量RT-PCR 分析引物设计
• 2.5.5 定量RT-PCR 操作方法
• 2.5.5.1 按下列组份配制反转录反应液（反应液配制请在冰上进行）
• 2.5.5.2 Real Time PCR 反应
• 2.6 序列比对
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA 提取电泳图
• 3.2 CDNA-AFLP 分析
• 3.2.1 山核桃cDNA 合成
• 3.2.2 预扩增
• 3.2.3 选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳图
• 3.3 特异片段克隆测序分析
• 3.3.1 回收二次扩增产物结果分析
• 3.3.2 纯化回收产物分析
• 3.3.3 重组质粒提取及酶切结果分析
• 3.3.4 测得的所有序列
• 3.4 定量RT－PCR 分析
• 3.5 序列功能分析
• 4 讨论
• 4.1 RNA 提取
• 4.2 CDNA-AFLP 体系的建立与优化
• 4.2.1 模板质量是影响实验结果的主要因素
• 4.2.2 cDNA-AFLP 反应条件的优化
• 4.2.3 差异片段的检测
• 4.3 特异片段克隆测序
• 4.4 定量RT－PCR
• 4.5 嫁接调控网络初探
• 4.5.1 4 个基因可能在嫁接过程中参与信号转导和IAA 运输相关基因的表达调控
• 4.5.2 水孔蛋白PIP18 在山核桃嫁接过程中增强表达
• 4.5.3 生长素响应因子（ARF）在山核桃嫁接过程中抑制表达
• 4.6 下一步工作构想
• 5 结论
• 参考文献
• 附表
• 作者简介
• 攻读硕士期间发表论文
• 致谢