胆汁淤积基因在妊娠期肝内胆汁淤积症发病机制和在异常胎盘胆汁酸排泌机制中作用的研究

论文摘要

第一部分应用PCR-SSCP技术检测妊娠期肝内胆汁淤积症MDR3基因突变研究背景妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP）是一种妊娠期特发性疾病。ICP对患者本人的影响仅限于妊娠期,妊娠结束后患者临床症状自然消失、血清生化迅速恢复正常,预后良好;但ICP胎儿早产、心率异常、羊水粪染及围产儿死亡率明显增加。该病病因尚未明了,研究结果提示遗传因素在该病发病机制中起相当关键作用。MDR3基因（也称为ABCB4基因）蛋白产物是肝脏毛细胆管膜磷脂输出泵,维持着胆汁磷脂的含量,MDR3基因突变可引起遗传性肝内胆汁淤积症的发生。目前,法国、芬兰等欧洲学者已在这些国家ICP患者中发现与疾病有关的MDR3基因突变;而我国学者尚未开展MDR3基因突变在本国ICP人群中的分布情况的调查工作。目的检测我国ICP患者MDR3基因外显子突变的分布情况,探讨该基因在ICP发病机制中的作用。方法收集30例ICP孕妇,检测其肝功能、血清总胆汁酸（TBA）、γ-谷胺酰转肽酶（γ-GT）水平,同时采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术分析ICP患者MDR3基因5个外显子突变情况。随机抽取60例同期正常晚期妊娠妇女作为对照组。结果30例ICP患者均出现肝功能异常、血清TBA升高等生化改变,与对照组相比均有显著性差异（P<0.05）。4例ICP孕妇血清y-GT升高,而对照组无一例异常。所有ICP患者及60例正常妊娠妇女PCR均扩增出MDR3基因5个外显子目的片段,但SSCP分析没有发现异常迁移条带。结论在欧洲患者MDR3基因突变频率较高的5个外显子中,本地区ICP孕妇未发现已知突变及新的未知突变。MDR3基因突变可能不是本地区ICP患者发病的主要原因。第二部分MDR3（ABCB4）、BSEP（ABCB1 1）和FIC1（ATP8B1）基因在绒毛和正常妊娠胎盘组织表达的研究研究背景胎盘作为妊娠期的特殊器官,承担了未成熟胎儿几乎所有器官的功能,在胎儿物质转运过程中起重要作用,包括胆汁酸的排泌。胎儿物质经过胎盘组织屏障与母体相互交换。胎儿胆汁酸依赖人类滋养细胞基底膜（胎儿面）和游离缘（母体面）质膜上存在的胆汁酸转运载体以易化扩散或主动运输的方式通过胎盘。其中部分载体蛋白具有单向转运特点,在整个转运过程中起垂直转运的作用。然而,关于胎盘屏障胆汁酸转运系统的特征尚需进一步研究。FIC1（ATP8B1）、BSEP（ABCB11）和MDR3（ABCB4）等三种基因参与肝脏胆汁分泌过程,突变可分别引起多种遗传性肝内胆汁淤积症。关于这三种基因在人类胎盘上的表达情况,人们知之甚少。目的了解三种胆汁淤积相关基因F1C1（ATP8B1）、BSEP（ABCB11）和MDR3（ABCB4）在正常绒毛和胎盘组织在转录水平和蛋白水平有无表达和表达情况,了解这三种基因和人类胎盘胆汁酸排泌功能的关系。方法选择正常妊娠6-12周的孕妇（早孕组）15例和妊娠38-40周的孕妇（晚孕组）20例,采用实时定量逆转录-聚合酶链反应技术（Real Time RT-PCR）检测绒毛和胎盘组织中三种基因的mRNA。采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶（S-P）法分别检测MDR3、BSEP在上述35例胎盘组织中的表达,并通过免疫印迹技术分析两组胎盘组织中MDR3蛋白和BSEP蛋白的含量。结果在所有绒毛和胎盘组织中均检测到三种基因的mRNA。与早孕组相比,晚孕组胎盘组织中MDR3基因的表达水平增加,有显著性意义（P<0.05）;FIC1基因表达水平则明显下降（P<0.01）,差别有极显著意义;而BSEP基因的表达无改变（P>0.05）。MDR3蛋白、BSEP蛋白在正常绒毛和胎盘组织中均有表达,且MDR3、BSEP蛋白在正常早孕绒毛及晚期妊娠胎盘分布范围基本一致,主要分布在绒毛合体滋养细胞母体面游离缘。与早孕组相比,正常组胎盘MDR3的表达显著升高（P<0.05）,而BSEP的表达无显著性差异（P>0.05）。结论三种与胆汁淤积相关的基因FIC1、MDR3和BSEP在正常绒毛和胎盘组织中均有表达。根据胎儿生长的需要胎盘,妊娠期间MDR3基因、FIC1基因和BSEP基因mRNA和蛋白表达发生变化,可能参与了胎盘胎儿胆汁酸的排泌。第三部分MDR3（ABCB4）、BSEP（ABCB1 1）和FIC1（ATP8B1）基因在妊娠期肝内胆汁淤积症患者胎盘胆汁酸排泌机制中作用的研究研究背景ICP胎儿预后不良发生率较高,但其机制尚不清楚。有研究显示胎儿胆汁酸升高与ICP羊水粪染、胎儿窘迫、死胎的发生有关。生理妊娠情况下,胎盘维持着母胎胆汁酸动态平衡。ICP时,胎盘从胎儿至母体方向排泌胆汁酸的效率下降,导致ICP胎儿血清胆汁酸明显升高。因此,ICP胎盘胆汁酸排泌功能受损可能是造成ICP胎儿预后不良的环节之一。MDR3、BSEP及FICl等三种基因与遗传性肝内胆汁淤积有密切关系,我们前面的研究已经发现这三种基因在足月妊娠胎盘中均有表达。MDR3、BSEP及FIC1等三种基因在ICP胎盘的表达情况以及与ICP受损的胆汁酸排泌功能的关系值得研究。目的检测正常妊娠和ICP胎盘组织中三种胆汁淤积相关基因MDR3（ABCB4）、BSEP（ABCB11）及FIC1（ATP8B1）的表达,探讨这三种胆汁淤积相关基因与ICP胎盘胆汁酸排泌功能下降的关系。方法选择正常妊娠38-40周的孕妇（正常组）20例和36例ICP患者（ICP组）,采用实时定量RT-PCR技术检测两组胎盘组织中三种基因的mRNA表达;免疫组化染色法检测MDR3蛋白和BSEP蛋白在ICP胎盘组织中的表达部位;并通过免疫印迹技术检测两组胎盘组织中MDR3蛋白和BSEP蛋白的表达。结果在ICP组胎盘组织中检测到MDR3、BSEP及FIC1三种基因mRNA和MDR3蛋白、BSEP蛋白的表达。与正常组相比,ICP组胎盘组织中MDR3基因的mRNA和蛋白水平均下降,有极显著性意义（P<0.01）;而BSEP mRNA和蛋白表达水平基因在ICP组胎盘组织和正常组胎盘组织中的表达无差异（P>0.05）。ICP组FIC1基因mRNA呈弱表达,明显低于正常组,差别有显著意义（P<0.05）。结论FIC1基因、MDR3基因和BSEP基因在ICP胎盘组织中均有表达。ICP胎盘中BSEP基因的表达可能与胎盘胆汁酸排泌功能无关;而ICP胎盘MDR3基因和FIC1基因表达水平明显下降,这可能与胎盘胆汁酸排泌功能受损、ICP的不良妊娠结局有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分 应用PCR-SSCP技术检测妊娠期肝内胆汁淤积症MDR3基因突变
• 第二部分
• 实验一 应用Real Time RT-PCR法进行MDR3 （ABCB4）、BSEP （ABCB11）及FIC1 （ATP8B1）基因mRNA在绒毛和正常妊娠胎盘组织表达的研究
• 实验二 MDR3 （ABCB4）、BSEP （ABCB11）载体蛋白在绒毛和正常妊娠胎盘组织定位和定量表达的研究
• 第三部分 MDR3 （ABCB4）、BSEP （ABCB11）及FIC1 （ATP881）基因在妊娠期肝内胆汁淤积症胎盘组织表达的研究
• 小结与展望
• 综述
• 综述一 妊娠期肝内胆汁淤积症的遗传学研究进展
• 综述二 胎儿、胎盘的胆汁酸、胆红素排泌分子机制及进展
• 附录
• 公开发表论文目录
• 致谢