松苗猝倒病生物防治细菌与定殖规律研究

论文摘要

湿地松（Pinus elliottii）是我国南方及湖北省重要的造林树种，其所产松脂是重要的化工原料。在湿地松育苗期间，往往因猝倒病的危害，严重影响了育苗和造林。国内外研究表明，松前猝倒病由丝核菌（Rhizoctonia）、腐霉菌（Pythium）、镰孢菌（Fusarium）、链格孢菌（Alternaria）、葡萄孢菌（Botrytis）、盘多毛孢菌（Pestalotia）等属的多种真菌侵染引起，且不同地域病原菌种类不尽相同。本研究以湿地松苗为研究对象，在详细研究松苗猝倒病主要病原菌和根际微生物分布与变化规律的基础上，以荧光假单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌等引进与本土生防菌为研究材料，采用分子检测技术，对生防菌在松苗根际的定殖规律以及抑病效果进行了研究，主要内容及结论如下：（一）松苗根际微生物分布及数量变化规律湿地松根际土壤中存在着大量的微生物，每克土中真菌菌落数量一般在1×105～3.5×106CFU（colony forming units）左右，细菌每克土一般为107～108CFU；真菌数量变化的高峰期出现在9月份，细菌数量变化高峰期出现在苗木移栽的4月份。细菌的种群数量增长速度快于真菌，在根际表面定殖的时间也早于真菌。（二）松苗猝倒病主要病原真菌及致病性湖北省湿地松苗圃的松猝倒病主要病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn.）、链格孢菌（Alternaria alternata（Fr.）Keissl.）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）。立枯丝核菌的致病力最强，第7d致病率可达92.6％，尖孢镰刀菌致病力次之，第7d的致病率最高可达89.5％，链格孢菌致病力较弱，第7d的致病率为48％，但第10d可达80％。（三）生物防治细菌的筛选与鉴定选择镰刀菌属（Fusarium）中致病力最强的6株病原菌为供试菌株，对湿地松根际320株细菌分离物进行了拮抗性筛选，共获得27株具有拈抗性的细菌菌株，其中12株具有弱的拮抗性，5株具有中等程度的拮抗性，10株为强的拮抗性细菌菌株；用16S rDNA测序分析方法，对10株拮抗细菌分离物进行了鉴定，7株为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia），2株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），1株待定。（四）松苗根际生物防治细菌定殖规律研究用美国引进的8株荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens Q2-87，1M1-96，HT5-1，Pf-5，MVP1-4，FFL1R8，2-79，Q37-87）菌株和本土筛选得到的1株洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia C23）菌株进行平皿对峙试验，供试病原真菌为立枯丝核菌A、B，尖孢镰刀菌和链格孢菌：结果表明9株生防菌对链格孢菌和丝核菌的拮抗能力强，对镰刀菌的拮抗能力都较弱；其中C23和Q2-87对丝核菌和链格孢菌都表现出较好的拮抗作用；室内外根际接菌后的分子检测表明：两个菌株在湿地松幼苗根际都具有较强的定殖能力。本研究从松苗根际筛选得到本土生防细菌，并获得了确定的室内外拮抗效果，初步明确了生防细菌定殖规律，是我国松苗猝倒病生物防治研究的重要进展。本文研究结果为应用生物防治解决松苗猝倒病防治难题奠定了基础，而松苗猝倒病的生物防治研究将有利于促进林木病害生物防治工作的深入和提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 第一节 松苗猝倒病
• 1.1 分布与危害
• 1.2 症状
• 1.3 病原
• 1.4 发生规律
• 1.5 防治措施
• 第二节 植物病害生物防治
• 2.1 概论
• 2.2 生防细菌的种类
• 2.3 根际主要生物防治细菌
• 2.3.1 假单胞菌（Pseudomonas Migula）
• 2.3.2 伯克霍尔德菌（Burkholderia Yabunchi et al.）
• 2.3.3 芽孢杆菌（Bacillus Cohn）
• 2.4 生防菌的应用
• 第三节 假单胞菌生物防治机理
• 3.1 噬铁素（siderophores）
• 3.2 抗生素（antibiotics）
• 3.2.1 吩嗪羧酸（phenazine-1-carboxylate acid，PCA）
• 3.2.2 二乙酰间苯三酚（2，4-diacetylphloroglucinol，DAPG）
• 3.2.3 吡咯菌素（Pyrrolnitrin，Prn）
• 3.3 氰化氢（HCN）
• 3.4 竞争
• 3.5 根际定殖
• 第四节 研究目的与内容
• 4.1 主要研究内容
• 4.2 技术路线
• 参考文献
• 第二章 松苗根际微生物分布及数量变化规律研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 土样
• 1.1.2 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 采样时间
• 1.2.2 采样方式
• 1.2.3 根系微生物分析
• 2 结果与分析
• 2.1 实验结果
• 2.2 分析
• 3 讨论与小结
• 参考文献
• 第三章 松苗猝倒病主要病原真菌及致病性研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 培养基与试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 病原真菌分离
• 1.2.2 病原真菌致病性测定
• 1.2.3 病原真菌鉴定
• 1.2.3.1 形态学观察与鉴定
• 1.2.3.2 镰刀菌16S rDNA序列分析
• 1.3 病原真菌生物学特性
• 1.3.1 温度对菌丝生长的影响
• 1.3.2 pH对菌丝生长的影响
• 1.3.3 菌丝对碳、氮源的利用
• 1.3.4 光照对菌丝生长的影响
• 2. 结果与分析
• 2.1 病原真菌初步鉴定
• 2.2 病原真菌致病性测定
• 2.3 三个主要病原真菌菌株的鉴定
• 2.3.1 BY31真菌菌株的鉴定
• 2.3.2 BY11真菌菌株的鉴定
• 2.3.3 BY36真菌菌株的鉴定
• 2.4 三种病原真菌的生物学特性观察
• 2.4.1 病原菌对氮源的利用
• 2.4.2 病原菌对碳源的利用
• 2.4.3 温度对菌丝生长的影响
• 2.4.4 pH值对菌丝生长的影响
• 2.4.5 光照对菌丝生长的影响
• 3. 小结与讨论
• 参考文献
• 第四章 生防细菌的筛选与鉴定
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细菌材料来源
• 1.1.2 供试病原真菌与细菌
• 1.1.3 试剂与培养基
• 1.1.4 引物、酶及抗生素
• 1.1.5 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 松苗根际细菌的分离
• 1.2.2 生防菌株的室内筛选
• 1.2.3 拮抗细菌的16S rDNA序列分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 根际细菌
• 2.2 生防菌株的室内筛选
• 2.3 拮抗细菌16S rDNA序列分析
• 3. 小结与讨论
• 参考文献
• 第五章 生防菌在松苗根际的定殖研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 土壤与树种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 供试菌株
• 1.1.4 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌拮抗性测定
• 1.2.2 细菌定殖与抑病试验
• 1.2.2.1 土壤和种苗
• 1.2.2.2 生防菌准备
• 1.2.2.3 接种处理
• 1.2.2.4 生防菌平皿检测
• 1.2.2.5 定殖检测
• 1.2.2.6 抑病效果
• 2. 结果与分析
• 2.1 抑菌测定结果
• 2.2 生防菌根际定殖结果
• 2.2.1 不同根段上的分布
• 2.2.2 室外定殖结果
• 2.2.3 生防菌的根部定殖动态
• 2.2.4 抑病效果
• 3. 小结与讨论
• 参考文献
• 第六章 研究结论
• 1. 主要结论
• 2. 创新点
• 3. 进一步研究设想
• 附录一
• 缩略语表
• 附录二
• 各种培养基的组成
• （1） 查彼（Czapek）培养基
• （2） Luria-bertani（LB）培养基
• （3） 金（King）氏（KMB）培养基
• （4） 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基
• （5） 马铃薯胡萝卜琼脂（PCA）培养基
• +）培养基'>（6） 改进型PDA（1/2 PDA⁺）培养基
• （7） 马铃薯琼脂（PA）培养基
• （8） 米饭培养基
• 图版
• 详细摘要