论文摘要
研究背景支气管哮喘是一种世界性疾病。近年来,此病发病率有逐渐增多的趋势。据WHO报道,在全世界范围中,哮喘相关的经济花费比结核病和艾滋病的总数还高,并预测2025年将会出现1亿例新的哮喘病患者。哮喘病将带给各国政府、家庭及患者十分沉重的负担。支气管哮喘是由多种细胞（嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和其分泌的炎症介质参与的气道慢性炎症性疾病。支气管痉挛、黏膜水肿、气道分泌物增加、气道高反应是哮喘患者急性发作的重要特征。由于哮喘对人类的严重危害,医学上从各个角度对哮喘进行了研究,尤其免疫学方面的研究已经成为热点,并已取得许多进展。哮喘的发病机制极为复杂,迄今尚未阐明,现被较多学者接受的理论是气道慢性炎症学说。10余年来,许多学者对CD4+T淋巴细胞在哮喘的发生、发展中的作用已经有了较深入的认识,认为Th1/Th2失衡理论在研究哮喘发病机制中发挥了重要作用,Th2功能增强、Th1功能抑制可导致哮喘的发生。但是,近年来从哮喘临床现象和有关动物实验发现,并不能完全用Th1/Th2失衡理论来解释哮喘的发病机理。目前,免疫学上认为,哮喘的发生主要是由于机体免疫耐受功能受损,导致免疫细胞及其成分对自身组织结构和功能平衡的破坏。近几年研究也表明,调节性T淋巴细胞与哮喘炎症和其在外周维持机体自身免疫耐受可能有着密切的关系。T细胞在受到特异性抗原刺激后,并在细胞因子诱导下可以具有调节性的功能特征,即调节性T淋巴细胞（Tregs）, Tregs涉及抗感染免疫、肿瘤免疫、移植免疫、变态反应等许多病理性免疫过程,对维持机体免疫自稳、防止自身免疫病具有极其重要的作用。目前已发现各种Tregs亚群,包括了CD4+Treg细胞、Th3细胞、Tregl细胞、自然杀伤（NK）细胞、Thl7细胞和CD8+Treg细胞等。CD4+Treg是研究较多的调节细胞,它特异性的表达Foxp3,即CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞。大量研究证实,CD4+CD25+T细胞在维持免疫耐受中起着关键性作用。在哮喘的发病中也起着重要的调节作用,它可以抑制Th2型反应及嗜酸粒细胞增多,抑制哮喘发生。有研究发现哮喘患者体内CD4+Treg细胞数量下降,功能减低。从体外向哮喘模型动物体内输入CD4+Treg可减轻气道高反应性、嗜酸粒细胞浸润和Th2细胞因子的产生。国外学者报道,Tregs具有抑制哮喘发作及过敏原对机体产生的迟发性过敏反应。随着研究的深入,发现Tregs中CD8+Treg的作用尤为重要,在过敏性反应中CD4+Treg诱导抑制作用的发生,而CD8+Treg是发挥抑制作用的效应细胞。CD8+CD28-T细胞是近年来证实的另一种重要的调节性T细胞,是CD8+Treg的主要表型之一,Filaci等人经表型分析发现90%以上的CD8+抑制性T淋巴细胞（现习惯称为CD8+调节性T淋巴细胞）为CD28-,缺乏CD28表达的CD8+CD28-T细胞同CD4+CD25+T细胞一样,具有免疫抑制作用。有研究报道CD8+CD28-T细胞在人类肿瘤中通常存在并发挥着重要作用,它们既能抑制T细胞增殖又能抑制其细胞毒性；CD8+CD28-T细胞有参与免疫耐受的证据,并且此细胞升高往往与移植器官功能良好、免疫耐受的出现等呈现正相关,研究显示CD8+CD28-T细胞的出现可以作为评价耐受是否出现的一个指征。但是,CD8+调节性T细胞在生理及各种病理条件下,通过不同的机制调节着机体的免疫能力,并且在一定的条件下具有细胞毒的活性,据文献报道巨细胞病毒,EB病毒,带状疱疹病毒感染时可诱导出CD8+CD28-T细胞介导病毒特异性的溶细胞的活性,由此说明在病毒感染中CD8+CD28-T细胞具有细胞毒的活性。Hamzaoui等人研究发现重症及轻者哮喘患者痰中CD8+CD28-T细胞较正常人痰中明显增多。有研究表明CD8+Treg能否抑制迟发性过敏反应与CD94/NKG2A受体密切相关,以及CD8+CD28-T细胞需依靠IL-10、IFN-γ、IL-6等细胞因子而发挥抑制功能。然而,目前对于哮喘中CD8+CD28-T细胞的是否有免疫抑制的作用及有关机制研究甚少。我们通过建立哮喘模型,检测哮喘小鼠外周血、支气管肺泡灌洗液（BALF）中的CD8+CD28-T细胞占淋巴细胞的百分比,用地塞米松治疗哮喘小鼠后CD8+CD28-T细胞百分比的变化,分析哮喘组外周血中CD8+CD28-T细胞百分比分别与气道内细胞总数、嗜酸粒细胞数、IgE、IFN-γ的相关系,以探讨CD8+CD28-T细胞在哮喘发病机制中的作用及在治疗哮喘时地塞米松对此细胞的影响。检测小鼠肺组织中NKG2A的表达,探讨哮喘小鼠中CD8+Treg细胞是否能发挥调节功能。第一部分哮喘动物模型的建立及验证目的：建立OVA致敏和激发的BALB/c小鼠哮喘模型方法：雌性BALB/c小鼠30只,4-6周龄,体重18～20g,由南方医科大学实验动物中心提供,随机分为3组,每组10只,哮喘组（A组）,地塞米松组（D组）,正常对照组（C组）。A组、D组小鼠于实验流程的第0d、14d给予腹腔注射含OVA与乳化的氢氧化铝及生理盐水混悬液200μl致敏,C组仅用含乳化的氢氧化铝混悬液200μl。A组小鼠于实验第21d起先给予1%OVA滴鼻液100μl滴鼻激发,随后接着给予2%OVA雾化液40ml,经超声雾化器雾化吸入,1次/d,每次持续约30min,连续6d。D组小鼠于实验第21d起先给予地塞米松lmg/kg,30分钟后接着行1%OVA滴鼻液100μl滴鼻,再给予2%OVA雾化液40ml雾化吸入。C组以生理盐水代替地塞米松注射液、滴鼻液、雾化液,方法同D组。每组小鼠以末次激发24h后,随机抽取3只小鼠,通过小鼠无创肺功能仪测定小鼠的气道反应性,测定倍增浓度的Mch 500ul（0,3.125,6.25,12.5,25,50, 100mg/ml）相应浓度下的增强呼吸间歇值（以下称Penh值）。剩余的小鼠以末次激发48h后摘取小鼠眼球放血后,开胸结扎右主支气管行支气管肺泡灌洗术,将外周血和回收过滤后的BALF,离心取上清液-20℃保存备用,BALF沉淀细胞在显微镜下行细胞总数、嗜酸粒细胞（EOS）计数；取右肺组织作HE染色病理切片,光学显微镜下观察组织形态、气道上皮损伤,气管及血管周围嗜酸粒细胞浸润情况。取外周血上清液、BALF上清液,根据小鼠IgE ELISE试剂盒的使用说明书测量小鼠外周血、BALF中IgE含量。结果：1.致敏及激发过程中小鼠行为学观察：A组、D组在第二次致敏15min后出现不同程度的呼吸急促,口唇、耳、尾巴黏膜发紫,立毛,趴在原地,活跃明显减低,整过程约持续2-3小时；C组小鼠未出现呼吸急促、紫绀等表现。A、D组小鼠在雾化激发后出现不同程度的头面部瘙痒,前肢搔鼻,烦燥不安,口唇紫绀,扭体反应等症状,而C组无明显上述症状。2.小鼠无创肺功能检测结果：随着Mch浓度的增加,A组、D组的Penh值逐渐增加,A组、D组于Mch浓度>6.25mg/ml开始,各Penh值均明显高于C组,p<0.05；A组与D组的Penh值相比较,A组高于D组,但仅在Mch浓度为6.25,12.5mg/ml时有统计学差异,两者P<0.01,其它浓度下Penh值无显著差异。3. BALF中细胞总数及EOS的变化：A组BALF中的细胞总数,EOS （4.89±3.49,1.75±0.75） 105/ml较C组（0.91±0.64,P=0.003；0.30±0.16,P=0.000）增多。D组的BALF中的细胞总数（2.11±1.22）105/ml较A组减少,P=0.027,但与C组比较无统计学意义,P=0.314；D组的BALF中的EOS（1.04±0.53）105/ml较C组增多,P=0.020；较A组减少,有统计学差异,P=0.024。4.小鼠肺组织的病理变化：A组、D组中支气管、血管周围,肺间质及肺泡腔内可见嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润,气道上皮损伤,结构紊乱,气道内杯状细胞肥大增生,分泌大量黏液并有粘液栓形成,A组较D组严重。C组肺组织气道结构清晰,气道纤毛上皮排列整齐,无明显的炎症改变。5.外周血、BALF中IgE含量变化：A组、D组的血清IgE含量（37.47±6.18、25.93±2.71） ug·ml-1较C组（18.16±4.45）ug·ml-1增多,P=0.000,P=0.006,均有显著性差异；D组较A组减少,P=0.000。A组、D组的BALF中IgE含量（26.10±7.18、13.57±2.11） ug·ml-1较C组（6.71±1.23） ug·ml-1增多,P=0.001,P=0.000,均有统计学意义；D组较A组减少,有统计学差异,P=0.008。结论：根据不同组间小鼠的症状体征,再结合气道内细胞总数、EOS、活体肺功能、肺组织病理、IgE的情况,证明OVA致敏和激发的BALB/c小鼠哮喘模型建立成功。哮喘小鼠经地塞米松lmg/kg治疗后可减轻气道炎症,缓解气道高反应性,缓解哮喘症状。第二部分：哮喘小鼠中CD8+CD28-T细胞的观察及地塞米松对其干预影响目的：探讨CD8+CD28-T细胞在哮喘发病机制中的作用及用地塞米松治疗哮喘时此细胞是否受影响。方法：雌性BALB/c小鼠21只,4-6周龄,体重18～20g,由南方医科大学实验动物中心提供,随机分为3组,每组7只,A为哮喘组,D为地塞米松组,C为正常对照组。哮喘模型的制作方法及过程同第一部分内容。于末次雾化激发48h后,摘取小鼠眼球放血,置于肝素钠抗凝管内,接着开胸结扎右主支气管后行支气管肺泡灌洗术,回收BALF。取右肺肺组织置于4%多聚甲醛中固定。BALF离心后,上清液-20℃保存备用,而细胞沉淀,用PBS重悬。回收的BALF细胞悬液及抗凝血均置于4℃保存,备以流式细胞仪检测CD8+CD28-T细胞占淋巴细胞的百分比,当天8h内测完。部分BALF细胞悬液行细胞总数、嗜酸粒细胞数（EOS）。根据小鼠IFN-γ、IgE ELISE试剂盒使用说明书检测BALF中IFN-γ、IgE含量；分析哮喘组BALF中细胞总数、EOS、IFN-γ、IgE分别与外周血中CD8+CD28-T细胞占淋巴细胞百分比的相关性。结果：1.致敏及激发过程中小鼠行为学观察：同第一部分。2. BALF中细胞总数及EOS的变化：A组小鼠BALF中细胞总数、EOS （5.56±4.06、3.29±2.23） 105/ml均较C组（0.91±0.65,P=0.003、0.43±0.37,P=0.001）明显增多;D组BALF中的细胞总数、EOS（2.59±1.69、1.11±0.73） 105/ml均较A组减少,P=0.044,P=0.008；D组BALF中的细胞总数和EOS与C组相比,均无统计学意义,P=0.234,P=0.363。3.小鼠肺组织的病理变化：A组、D组肺组织病理切片见支气管、血管周围,肺间质及肺泡腔内可见嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润,气道上皮损伤,结构紊乱,气道内杯状细胞肥大增生,分泌大量黏液并有粘液栓形成,A组较D组严重。C组肺组织气道结构清晰,气道纤毛上皮排列整齐,无明显的炎症改变。4. BALF中IFN-γ含量变化：A组、D组的BALF中IFN-γ含量（37.44±21.01、77.35±37.71）ng·L-1,较C组（130.88±32.23）ng·L-1减少,有显著差异性,P=0.000,P=0.005。D组较A组多,P=0.027,有统计学意义。5. BALF中IgE含量变化：A组、D组的BALF中IgE含量（23.84±5.97、13.15±2.22） ug·ml-1较C组（6.13±1.03）ug·ml-1增多,P=0.001、P=0.000,均有统计学意义；D组较A组减少,P=0.007,有显著性差异。6.外周血、BALF中CD8+CD28T细胞占淋巴细胞的百分比结果：A组、D组外周血中CD8+CD28T细胞的百分比（18.68±4.12、13.43±2.90）%均明显较C组（8.43±4.60）%增多,P=0.000、P=0.029,均有统计学意义；D组外周血中CD8+CD28T细胞百分比较A组减少,P=0.023,有统计学差异。A组、D组BALF中CD8+CD28T细胞的百分比（1.25±0.40、0.66±0.49）%均明显较C组（0.21±0.19）增多,P=0.000、P=0.041,均有统计学意义；D组BALF中CD8+CD28-T细胞百分比较A组减少,有统计学差异,P=0.010。7.哮喘组Pearson相关分析结果：A组BALF中细胞总数与其血中CD8+CD28-T细胞百分比成显著正相关（r=0.806, P=0.029）; BALF中EOS与血中CD8+CD28-T细胞百分比成显著正相关（r=0.804, P=0.029）; BALF中IgE与血中CD8+CD28-T细胞百分比成显著正相关（r=0.864, P=0.012）; BALF中IFN-γ与血中CD8+CD28-T细胞百分比不成在相关性（r=0.124,P=0.792）,无统计学意义。结论：CD8+CD28-T细胞的增多与哮喘小鼠气道炎症发生有明显相关性,可能是哮喘发病重要因素之一,地塞米松可有效抑制哮喘气道炎症,并有可能通过抑制CD8+CD28-T细胞的表达和功能而减轻哮喘的症状。第三部分：哮喘小鼠中CD8+Treg细胞的调节机制研究目的：检测小鼠肺组织中NKG2A的表达,以探讨在哮喘小鼠中CD8+Treg细胞是否能正常发挥其抑制调节功能。方法：雌性BALB/c小鼠21只,4-6周龄,体重18～20g,由南方医科大学实验动物中心提供,随机分为3组,每组7只,A为哮喘组,D为地塞米松组,C为正常对照组。哮喘模型的制作方法及过程同第二部分内容。由第二部分取得的肺组织,置于4%多聚甲醛溶液中固定,常规取材、脱水、石蜡包埋、制备石蜡切片。石蜡切片经脱蜡,水化,抗原修复,加对应的Ⅰ、Ⅱ抗体,显色,脱水,封片,镜检。NKG2A表达以染色呈棕黄色为阳性,光镜下观察,所有切片放大倍数为400倍。NKG2A的表达每张切片观察6个视野,免疫组化结果采用Imaga-ProPlus 6.0软件分析以单个视野下平均光密度,以IOD强度来表示NKG2A表达高低。结果：A组、D组肺组织表达NKG2A的IOD为（24.29±6.34、17.28±4.13）较C组（10.85±3.71,P=0.000、P=0.024）均增高,两者都有显著差异性。D组较A组减少,有统计学差异性,P=0.015。结论：哮喘小鼠的肺组织高表达NKG2A,不利于CD8+Treg细胞的调节抑制功能的正常发挥；地塞米松可抑制肺组织中NKG2A的表达。
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