论文摘要
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质亚基组成的最常用的方法，也是蛋白组学研究的核心技术。本实验组在乙醇酸氧化酶（GO）的研究过程中首次发现，从菜心叶片中提取GO，在SDS-PAGE中，只有一条40 kD大小的蛋白带；而在SDS-醋酸薄膜电泳中，当蛋白点样在薄膜中央时，同时存在向正极和向负极泳动的蛋白带。有证据表明，在SDS电泳中向正极泳动的40 kD蛋白就是GO的亚基；而在SDS电泳中向负极泳动的蛋白则是未知蛋白，它和GO的关系有待研究。为阐述的方便，本论文把在SDS电泳中向负极泳动的蛋白统称为负极蛋白。已经从菜心叶片材料中获得负极蛋白，发现其苯丙氨酸的含量可达60％以上（曾秋莲等，2006）。但是苯丙氨酸的含量特别高，该数据是否可靠有必要做进一步的证实。从菜心叶片材料和GO混合蛋白中可以获得负极蛋白，而类似的负极蛋白是否存在于动物中，负极蛋白的性质如氨基酸组成和大小，负极蛋白和GO的关系，以及负极蛋白的泳动机理等还不是很清楚。本论文对以上这些问题做进一步的研究。菜心叶片粗蛋白经制备性SDS-PAGE，电泳后从负极缓冲液中获得负极蛋白。测出该负极蛋白的苯丙氨酸的含量高达75％，再次验证了之前的结果。提取动物兔肝粗蛋白，经SDS-醋酸薄膜电泳。结果发现同时存在向正极和负极泳动的蛋白带，证明在动物兔肝粗蛋白中也含有负极蛋白。本论文以菜心叶片粗蛋白为材料，通过10％醋酸沉淀、硫酸铵分部沉淀、Sephadex G-50凝胶过滤和DEAE-Cellulose-52阴离子交换层析柱，获得高活性的菜心GO混合蛋白。提取GO过程中的各步骤的蛋白样品经SDS-醋酸薄膜电泳，同样可以发现存在向正极和负极泳动的蛋白带。可见，和以往的实验结果相类似，本研究所获得的GO混合蛋白实际上还含有一个负极蛋白。经系列提取步骤得到的GO在80mmol／L Tris-HC1（pH8.3）中是可溶性的，其SDS-PAGE图谱与保存时间有关：最初呈现54 kD，但很快呈现40 kD。而GO在50％的硫酸铵中为沉淀，则在SDS-PAGE中只呈现40 kD，GO比活也大幅度上升。据此推测，新提取的GO和负极蛋白紧密结合，即使经SDS变性处理，GO和负极蛋白仍不解离而呈现54 kD。GO亚基大小应该是40 kD，而负极蛋白亚基大小应该是14 kD左右（54kD-40 kD=14 kD）。提取的GO在4℃冰箱保存24h后，GO和负极蛋白相互解离，在SDS-PAGE中分别向正极和负极泳动。硫酸铵沉淀会加速GO和负极蛋白相互解离。提取的GO制备性SDS-PAGE，并在电泳后从负极缓冲液中获得这个负极蛋白。氨基酸组成分析表明，负极蛋白富含苯丙氨酸，苯丙氨酸含量为75％；而半胱氨酸的含量很低，以至未能被测定出来。该结果和GO 40 kD亚基的氨基酸组成相差悬殊：如GO 40 kD亚基富含半胱氨酸，半胱氨酸含量为10.25％；而苯丙氨酸的含量则很低，以至未能被测定出来。表明GO和这个负极蛋白的结构完全不同，是两个完全不同的蛋白。负极蛋白的碱性氨基酸的比例占总氨基酸的0.65％左右，并不是一个强碱性蛋白。本文测定了酸性的牛血清白蛋白、碱性的溶菌酶，以及提取的GO样品中蛋白与SDS的结合比率。发现牛血清白蛋白和溶菌酶均以1:1.4的比例与SDS结合为蛋白-SDS胶束。而GO与SDS的结合比例则十分不稳定，有时GO与SDS的结合比例仅为1:0.23，远低于1:1.4。因此，蛋白和SDS的结合比例偏低，可能是提取的GO混合蛋白中的负极蛋白向负极泳动的原因，而不是负极蛋白带大量的正电荷。因为：1)，负极蛋白的碱性氨基酸远低于强碱性的鱼精蛋白，它所带的正电荷的量要远少于鱼精蛋白。前人已经证实鱼精蛋白的碱性氨基酸占总氨基酸的比例高达40％，带大量的正电荷。2)，我们证实鱼精蛋白以1:1.4的比例和SDS结合为蛋白-SDS胶束。3)，前人已经证实鱼精蛋白SDS胶束在SDS-PAGE会沉淀。因此，鱼精蛋白的正电荷的量可能和SDS的负电荷的量相差无几，导致蛋白-SDS胶束不带净电荷而溶解度很低。4)，我们已经证实，GO能以1:0.23的比例与SDS结合，远低于1:1.4。进一步用SDS-凝胶过滤层析确定负极蛋白的亚基大小。提取的GO经SDS变性后，上Sephadex 6-100柱层析。该Sephadex 6-100柱层析的洗脱体积先经两种标准蛋白BSA（亚基大小为67 kD）和溶菌酶（亚基大小为14 kD）标定。证实提取的GO在SDS-Sephadex G-100柱层析中会出现两个峰，本文称第一个峰为GC-Ⅰ，第二个峰为GC-Ⅱ。把这两个峰蛋白的洗脱体积与BSA和溶菌酶的相比较，表明这两个峰蛋白的大小在67 kD和14 kD左右。这两个峰蛋白经SDS-PAGE，证实GC-Ⅰ蛋白出现向正极泳动的40 kD，而GC-Ⅱ蛋白不会向正极泳动。我们认为，Sephadex G-100柱层析的GC-Ⅱ蛋白可能是GO中的负极蛋白，其亚基大小在14 kD左右；而GC-Ⅰ可能是GO和负极蛋白紧密结合在一起的复合物（40 kD+2×14 kD）。提取的GO进一步经SDS-毛细管电泳，出现35 kD和18 kD两个峰。推测，35 kD蛋白和18 kD蛋白分别为GO和负极蛋白。