本文主要研究内容
作者鲁晶娣（2019）在《Bacillus nakamurai壳聚糖酶的酶学性质及其活性位点研究》一文中研究指出：壳聚糖（chitosan）是由甲壳素（chitin）经过脱乙酰作用得到的具有独特功能特性的天然阳离子聚合物,由D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成。研究表明壳聚糖在生活中每个领域都有广泛的应用,但由于壳聚糖分子量较大,不易溶于水,只能溶解在某些酸性溶液中,严重阻碍了壳聚糖的应用价值。壳聚糖酶水解壳聚糖产生低分子量的壳寡糖具有十分广泛的应用,构建具有高酶活的壳聚糖酶对扩大壳聚糖在工业、医药及化妆品等领域应用具有十分重要的作用。本实验初步探究了Bacillus nakamurai壳聚糖酶的酶学性质及活性结合位点,主要内容及结果如下:1.根据NCBI网站GeneBank数据库所提供的Bacillus nakamurai壳聚糖酶氨基酸序列（登录号:WP061527864.1）,经密码子优化设计合适大肠杆菌编码基因的DNA序列,在基因序列的两端分别添加限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Sall I酶切位点,送由公司合成该基因。将融合表达载体pGEX-4T-3与合成的壳聚糖酶基因通过DNA T4连接酶连接,再转化到大肠杆菌中,构建重组菌株E.coil BL21-pGEX-4T-ChiA。2.利用生物信息学软件对Bacillus nakamurai壳聚糖酶进行分析,结果显示该壳聚糖酶基因长834bp,编码278个氨基酸,编码的蛋白属于GH46家族糖苷水解酶家族。等电点为8.87,分子量约为31.22KDa。二级结构预测发现该酶包括16个α螺旋,5个β折叠和一些无规则卷曲形状构成。预测壳聚糖酶的三级结构表明该壳聚糖酶主要结构呈哑铃状,有上、下两个结构域,由一段螺旋连接,其中有一个β-折叠与一些无规则卷曲组成的棍状结构在结构底部向外延伸。3.通过添加IPTG对重组蛋白诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测显示出一条约为31kDa的条带。为了提高蛋白表达量,对IPTG浓度,诱导温度和诱导时间进行优化,结果表明,在30℃、0.07mmoL/L IPTG、诱导6h为最优的蛋白表达条件。然后利用GST亲和层析的方法进行纯化,纯化得到的壳聚糖酶纯酶液浓度为10.932μg/mL。4.以脱乙酰度大于90%的壳聚糖为底物,采用DNS测定酶活力的方法测定重组壳聚糖酶的酶活,并对酶学性质进行了研究。结果显示:酶促反应的最适温度为37℃,在37℃下处理一个小时,剩余酶活在90%以上,在50℃处理20min酶活急剧下降,说明该酶在常温下有较好的稳定性;最适反应pH为4.5,在45.5pH值范围内处理1h剩余酶活仍剩余80%以上,说明该酶在微酸性环境下有较好的活性和稳定性。在Ag+、Hg+离子存在的酶促反应中完全抑制壳聚糖酶的活性;Cu2+、Zn2+、Ni+、Fe3+在酶促反应中对壳聚糖酶的活性有部分抑制作用;而Mn2+、Ca2+对壳聚糖酶的酶活性有激活作用。K+、Na+、EDTA对壳聚糖酶的酶活性无明显影响。5.以小分子壳聚糖为底物,利用Autodock软件将壳聚糖与壳聚糖酶进行对接,分析底物与壳聚糖酶结合位点,根据自由结合能最低的分子对接构象确定最佳的结合位点。结果显示ARG73、ASP71、THE236、ASP238、PHE54、SER243、GIU239、LEV69氨基酸为最优的结合活性位点。进一步突变参与活性位点的氨基酸,随后通过Gromacs技术对复合物进行动力学模拟。通过分析复合物RMSD、回旋半径Rg、及氢键个数等参数来判断复合物构象的变化。结果得出ASP71突变后对复合物构象影响较大,不利于底物与酶的结合。
Abstract
ke ju tang （chitosan）shi you jia ke su （chitin）jing guo tuo yi xian zuo yong de dao de ju you du te gong neng te xing de tian ran yang li zi ju ge wu ,you D-an ji pu tao tang tong guo β-1,4-tang gan jian lian jie er cheng 。yan jiu biao ming ke ju tang zai sheng huo zhong mei ge ling yu dou you an fan de ying yong ,dan you yu ke ju tang fen zi liang jiao da ,bu yi rong yu shui ,zhi neng rong jie zai mou xie suan xing rong ye zhong ,yan chong zu ai le ke ju tang de ying yong jia zhi 。ke ju tang mei shui jie ke ju tang chan sheng di fen zi liang de ke gua tang ju you shi fen an fan de ying yong ,gou jian ju you gao mei huo de ke ju tang mei dui kuo da ke ju tang zai gong ye 、yi yao ji hua zhuang pin deng ling yu ying yong ju you shi fen chong yao de zuo yong 。ben shi yan chu bu tan jiu le Bacillus nakamuraike ju tang mei de mei xue xing zhi ji huo xing jie ge wei dian ,zhu yao nei rong ji jie guo ru xia :1.gen ju NCBIwang zhan GeneBankshu ju ku suo di gong de Bacillus nakamuraike ju tang mei an ji suan xu lie （deng lu hao :WP061527864.1）,jing mi ma zi you hua she ji ge kuo da chang gan jun bian ma ji yin de DNAxu lie ,zai ji yin xu lie de liang duan fen bie tian jia xian zhi xing nei qie mei BamH Ihe xian zhi xing nei qie mei Sall Imei qie wei dian ,song you gong si ge cheng gai ji yin 。jiang rong ge biao da zai ti pGEX-4T-3yu ge cheng de ke ju tang mei ji yin tong guo DNA T4lian jie mei lian jie ,zai zhuai hua dao da chang gan jun zhong ,gou jian chong zu jun zhu E.coil BL21-pGEX-4T-ChiA。2.li yong sheng wu xin xi xue ruan jian dui Bacillus nakamuraike ju tang mei jin hang fen xi ,jie guo xian shi gai ke ju tang mei ji yin chang 834bp,bian ma 278ge an ji suan ,bian ma de dan bai shu yu GH46jia zu tang gan shui jie mei jia zu 。deng dian dian wei 8.87,fen zi liang yao wei 31.22KDa。er ji jie gou yu ce fa xian gai mei bao gua 16ge αluo xuan ,5ge βshe die he yi xie mo gui ze juan qu xing zhuang gou cheng 。yu ce ke ju tang mei de san ji jie gou biao ming gai ke ju tang mei zhu yao jie gou cheng e ling zhuang ,you shang 、xia liang ge jie gou yu ,you yi duan luo xuan lian jie ,ji zhong you yi ge β-she die yu yi xie mo gui ze juan qu zu cheng de gun zhuang jie gou zai jie gou de bu xiang wai yan shen 。3.tong guo tian jia IPTGdui chong zu dan bai you dao biao da ,jing SDS-PAGEdian yong jian ce xian shi chu yi tiao yao wei 31kDade tiao dai 。wei le di gao dan bai biao da liang ,dui IPTGnong du ,you dao wen du he you dao shi jian jin hang you hua ,jie guo biao ming ,zai 30℃、0.07mmoL/L IPTG、you dao 6hwei zui you de dan bai biao da tiao jian 。ran hou li yong GSTqin he ceng xi de fang fa jin hang chun hua ,chun hua de dao de ke ju tang mei chun mei ye nong du wei 10.932μg/mL。4.yi tuo yi xian du da yu 90%de ke ju tang wei de wu ,cai yong DNSce ding mei huo li de fang fa ce ding chong zu ke ju tang mei de mei huo ,bing dui mei xue xing zhi jin hang le yan jiu 。jie guo xian shi :mei cu fan ying de zui kuo wen du wei 37℃,zai 37℃xia chu li yi ge xiao shi ,sheng yu mei huo zai 90%yi shang ,zai 50℃chu li 20minmei huo ji ju xia jiang ,shui ming gai mei zai chang wen xia you jiao hao de wen ding xing ;zui kuo fan ying pHwei 4.5,zai 45.5pHzhi fan wei nei chu li 1hsheng yu mei huo reng sheng yu 80%yi shang ,shui ming gai mei zai wei suan xing huan jing xia you jiao hao de huo xing he wen ding xing 。zai Ag+、Hg+li zi cun zai de mei cu fan ying zhong wan quan yi zhi ke ju tang mei de huo xing ;Cu2+、Zn2+、Ni+、Fe3+zai mei cu fan ying zhong dui ke ju tang mei de huo xing you bu fen yi zhi zuo yong ;er Mn2+、Ca2+dui ke ju tang mei de mei huo xing you ji huo zuo yong 。K+、Na+、EDTAdui ke ju tang mei de mei huo xing mo ming xian ying xiang 。5.yi xiao fen zi ke ju tang wei de wu ,li yong Autodockruan jian jiang ke ju tang yu ke ju tang mei jin hang dui jie ,fen xi de wu yu ke ju tang mei jie ge wei dian ,gen ju zi you jie ge neng zui di de fen zi dui jie gou xiang que ding zui jia de jie ge wei dian 。jie guo xian shi ARG73、ASP71、THE236、ASP238、PHE54、SER243、GIU239、LEV69an ji suan wei zui you de jie ge huo xing wei dian 。jin yi bu tu bian can yu huo xing wei dian de an ji suan ,sui hou tong guo Gromacsji shu dui fu ge wu jin hang dong li xue mo ni 。tong guo fen xi fu ge wu RMSD、hui xuan ban jing Rg、ji qing jian ge shu deng can shu lai pan duan fu ge wu gou xiang de bian hua 。jie guo de chu ASP71tu bian hou dui fu ge wu gou xiang ying xiang jiao da ,bu li yu de wu yu mei de jie ge 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自广西科技大学的鲁晶娣，发表于刊物广西科技大学2019-07-03论文，是一篇关于壳聚糖论文,壳聚糖酶论文,诱导表达论文,蛋白纯化论文,酶学性质论文,活性位点论文,突变论文,广西科技大学2019-07-03论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自广西科技大学2019-07-03论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：壳聚糖论文; 壳聚糖酶论文; 诱导表达论文; 蛋白纯化论文; 酶学性质论文; 活性位点论文; 突变论文; 广西科技大学2019-07-03论文;