论文摘要
目的：构建含鼻咽癌人源抗独特型单链抗体基因G22的真核表达载体，鉴定重组质粒真核表达的生物学活性，并将其制备成基因疫苗进行动物实验，为抗鼻咽癌疫苗的进一步研究奠定了基础。方法：PCR扩增G22 scFv基因，重组至真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建重组表达载体pcDNA3.1（+）-G22。将CNE2细胞经热休克预处理后，RT-PCR扩增人全长gp96基因，重组至真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建重组表达载体pcDNA3.1（+）-gp96。经酶切鉴定和DNA序列测定后，用脂质体法将重组质粒稳定转染入真核细胞，以Western Blotting和流式细胞术检测重组质粒的表达，进一步应用免疫组化和免疫荧光确定G22 ScFv基因表达的细胞定位。随后将重组质粒制备成基因疫苗，经肌肉注射免疫C57BL／6小鼠。一部分小鼠在末次免疫后15天起取血及脾组织，用间接ELISA、竞争抑制ELISA和流式细胞术检测G22 ScFv诱导的特异性免疫应答。另一部分小鼠于末次免疫后1周背部皮下分别接种5×106野生型CMT-93或转基因CMT-93／G22瘤细胞，观察荷瘤小鼠的肿瘤体积大小和生存期。结果：酶切鉴定和DNA序列分析证实，重组质粒pcDNA3.1（+）-G22和pcDNA3.1（+）-gp96构建成功，并经Western Blotting和流式细胞术等方法验证G22 scFv基因和人全长gp96基因能在真核细胞中正确表达。进一步用G22 scFv为免疫原，gp96为佐剂，以基因疫苗的形式免疫小鼠，可诱导产生抗鼻咽癌特异性抗体，其能竞争性抑制FC2McAb（针对鼻咽癌的单抗）与鼻咽癌细胞HNE2表面抗原的结合；可刺激小鼠的脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞升高；并对荷瘤小鼠表现免疫保护效应，延长生存期。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（+）-G22，并验证G22ScFv基因在真核细胞中表达的生物学活性。通过动物实验证明G22抗独特型单链抗体可诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答，延长荷瘤动物的生存期，为抗独特型单链抗体的临床应用提供了一定的实验依据。