双色荧光RNAi技术平台的建立和抗SARS-CoV RNAi的研究

论文题目: 双色荧光RNAi技术平台的建立和抗SARS-CoV RNAi的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 魏映辉

导师: 王丽颖

关键词: 绿色荧光蛋白,红色荧光蛋白,核衣壳蛋白

文献来源: 吉林大学

发表年度: 2005

论文摘要: RNA干涉(RNAi)是由双链RNA引起的同源RNA降解的现象,和病毒基因同源的小双链RNA可能成为新型的抗病毒药物。为了研制抗SARS-CoV的RNAi,建立了由两种质粒pcDNA3.0/GFP-X及pcDNA3.0/DsRed-U6-Y组成的反式双色荧光RNAi技术平台。pcDNA3.0/GFP-X载有与绿色荧光蛋白(GFP)基因位于同一读框的靶基因(X);在pcDNA3.0/DsRed-U6-Y的CMV启动子下游构建有红色荧光蛋白(DsRed)基因,在人U6启动子的下游可组装任一有干涉作用的小发夹RNA(shRNA)编码基因(Y)。用这两种重组质粒共转染细胞后,通过荧光显微镜或流式细胞仪选择性地分析显示红色荧光的细胞群中绿色荧光减弱的程度,以此来对任一靶基因进行定性及定量的RNAi研究。采用此技术平台,我们对根据SARS-CoV的核衣壳蛋白(NP)第953～971bp自行设计的小发夹RNA(shNP953)进行了RNAi研究,结果发现,这一新型小发夹RNA(shNP953)可以有效干涉SARS-CoV NP的表达。该结果为研制新型抗SARS病毒的药物提供了实验依据。此外,我们采用U6启动子-shRNA基因的PCR产物对多种自行设计的SARS-CoV同源shRNA的RNAi效应及其非特异性作用进行了初步的探讨。

论文目录:

英文缩写词表

前言

文献回顾

1 RNAi 研究的历史及概况

2 RNAi 的作用机制

2.1 转录后沉默机制

2.2 基因组DNA 甲基化机制

2.3 转译水平的基因沉默机制

3 RNAi 技术的应用

3.1 研究基因功能

3.2 疾病治疗

材料与方法

1 主要材料

1.1 限制性内切酶及其它试剂

1.2 质粒与菌株

1.3 培养基

1.4 引物的合成及用途

1.5 细胞株

1.6 仪器设备

2 主要方法

2.1 相关质粒的构建

2.2 U6-shRNA PCR Cassette 的制备

2.3 细胞转染

2.4 Vero 细胞病毒保护实验

2.5 半定量RT-PCR

实验结果

1 外源基因RNAi 技术平台的建立

1.1 顺式双色荧光RNAi 系统的构建及其RNAi 研究

1.2 反式双色荧光RNAi 系统的构建及其RNAi 研究

2 反式双色荧光RNAi 技术平台在SARS-CoV NP 的RNAi 研究中的应用

2.1 针对SARS-CoV NP 的反式双色荧光RNAi 系统的构建

2.2 针对SARS-CoV NP 的反式双色荧光RNAi 系统对SARS-CoV NP 表达的RNAi 研究

3 U6-shRNA PCR Cassette 对SARS-CoV NP 表达的RNAi 研究及对细胞非特异性激活的研究

3.1 U6-shRNA-PCR Cassette 对SARS-CoV NP 表达的RNAi 研究

3.2 U6-shRNA-PCR Cassette 对细胞非特异性激活的研究

图和照片

讨论

1 siRNA 制备方法的选择

1.1 shRNA 表达载体

1.2 shRNA 表达框架

2 siRNA 序列的选择

2.1 针对目标基因的siRNA 的选择

2.2 对照siRNA 序列的选择

2.3 loop 序列的选择

3 干涉核酸序列的转染

4 RNAi 效应的检测

4.1 目标基因表达被干涉的检测

4.2 非特异性效应的检测

结论

参考文献

攻读博士学位期间已(待)发表的文章

中文摘要

ABSTRACT

致谢

个 人 简 历

发布时间: 2005-08-26

参考文献

• [1].远红色双分子荧光互补系统的建立和应用[D]. 储军.华中科技大学2009
• [2].利用CRISPR/Cas9技术构建C3基因敲除猪模型和稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立[D]. 张纬.南京医科大学2017

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