氯丙嗪单独及与顺铂联合应用对宫颈癌hela细胞生长的研究

论文摘要

目的宫颈癌（cervical carcinoma）是女性最常见的一种恶性肿瘤,它的发病率仅次于乳腺癌,居女性恶性肿瘤第二位。传统的治疗方法是早期手术,放疗为主,化疗为晚期或复发患者的治疗方法。手术仅适于早期患者且创伤大,而放疗后女性内分泌功能受到损害,导致患者生活质量严重下降尤其是年轻女性患者。传统的化疗药物有不同程度的毒副作用并出现肿瘤对化疗药物的耐药反应,最终导致治疗失败。随着宫颈癌发病的年轻化和腺癌比例增加,患者对治疗后生活质量的要求更加提高。因此寻找一些毒性小、药物反应少且有一定疗效的药物治疗宫颈癌,或者利用它们增加化疗药物的敏感性就显得极其重要。本研究旨在研究氯丙嗪（Chlorom- azine）单独及与顺铂（cis-diamminedichloroplatinum, CDDP）联合用药对人宫颈癌hela细胞株体外生长的影响,以期为临床上药物治疗宫颈癌提供新思路。方法1细胞培养:常规方法复苏冻存于液氮罐中的人宫颈癌hela细胞,接种于含10%小牛血清RPMI-1640培养液的培养瓶中,置于370C, 5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养,每天观察细胞生长情况,待细胞生长至70%融合时（约2-3天）,胰酶消化,制成单细胞悬液,以备实验用。2采用四甲基偶氮唑蓝（tetrzolium-based colorimetric assay,MTT）比色法检测氯丙嗪、顺铂单独用药及氯丙嗪与顺铂联合用药对该细胞增殖的影响,测定吸光度（OD）值。流式细胞仪（FCM）测定氯丙嗪单独及与顺铂联合用药对hela细胞周期分布和凋亡的影响;流式细胞仪间接免疫荧光技术分析氯丙嗪单独及与顺铂联合用药后hela细胞bcl-2、Bax蛋白表达的变化;应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测联合用药后2小时及4小时后bcl-2、Bax mRNA表达量的改变。以β-actin作为内参照标准,对扩增产物通过凝胶扫描仪进行DNA电泳条带的光量子强度分析,分别将bcl-2、Bax/β-actin作为bcl-2、Bax mRNA表达水平的参数,对bcl-2、Bax产物相对定量。3采用isobolanalysis公式分析相互作用指数（Iteraction Index）,评价联合后的作用。如果相互作用指数>1,为两药拮抗作用;相互作用指数=1,为两药相加作用;相互作用指数<1,为两药协同作用。结果1 MTT比色法显示氯丙嗪、顺铂单独用药,浓度分别为(1×10-4、1×10-5、1×10-6mol/L)对hela细胞均具有抑制增殖作用。不同浓度的氯丙嗪及顺铂处理细胞24-72h后,与对照组相比,各处理组OD值有不同程度下降,差异具有显著性（p<0.05）。且随着药物浓度的增大、作用时间的延长,OD值逐渐下降。上述结果表明,氯丙嗪及顺铂对hela细胞的增殖抑制作用均有明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。2氯丙嗪(1×10-6mol/L)与顺铂( 1×10-4、1×10-5、1×10-6mol/L)联合用药作用hela细胞24-72小时后,与对照组相比,OD值有不同程度下降,差异具有显著性（p<0.05）。与顺铂单独处理组相比,OD值有不同程度下降,差异具有显著性（p<0.05）。且随着顺铂浓度的增大、作用时间的延长,OD值逐渐下降。上述结果表明,氯丙嗪与顺铂联合用药对hela细胞的增殖抑制作用均有明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系,推测两者之间有相互协同作用。3流式细胞仪检测hela细胞周期分布和凋亡显示:氯丙嗪单独及联合用药24小时后,随药物浓度增大,G0/G1期细胞逐渐增多;S期和G2/M期细胞则逐渐减少。且出现典型的亚二倍体凋亡峰,依浓度的增大而逐渐升高,凋亡百分率氯丙嗪组为32.97%;联合用药组分别为54.71%、65.11%。上述结果表明,氯丙嗪单独及联合用药24小时后可阻滞hela细胞周期进程于G1期,该作用呈剂量-效应依赖关系,并且hela细胞凋亡百分率依浓度的增大而逐渐增加。4流式细胞仪间接分析细胞bcl-2、Bax蛋白表达显示:含终浓度为10-6mol/L的氯丙嗪单独及与含终浓度为10-5、10-4mol/L的顺铂联合用药24小时后bcl-2的荧光指数FI值随处理组浓度增大而逐渐减少,Bax的荧光指数FI值随处理组浓度增大而逐渐增大。对于每一种蛋白,比较其处理组和对照组的FI值,差异具有显著性（p<0.05）。表明,氯丙嗪单独及联合用药后hela细胞bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调。5 RT-PCR结果示:联合用药前后bcl-2、Bax的mRNA表达量均改变,bcl-2的表达水平随处理组时间的延长而逐渐减少,Bax的表达水平随处理组时间的延长而逐渐增大。用药前后bcl-2、Bax/β-actin比值对bcl-2、Bax产物相对定量,进行对比,有显著差异（p<0.05）。表明,联合用药后hela细胞bcl-2 mRNA表达下调,Bax mRNA表达上调。6 isobolanalysis公式分析相互作用指数显示:氯丙嗪联合顺铂在细胞生长抑制率为50%时相互作用指数小于1。表明,氯丙嗪与顺铂联合应用后对hela细胞的增殖抑制有协同作用。结论1本试验首次通过体外试验证实氯丙嗪单独及与顺铂联合应用对hela细胞的生长有抑制作用。两药联合应用为协同作用,对宫颈癌hela细胞的增殖有抑制作用且作用呈时间-剂量依赖关系。联合用药与顺铂单独用药的抑制率进行统计学处理,两者有显著的差异（p<0.05）,证实氯丙嗪有体外辅助化疗的作用,亦可增加顺铂的敏感性。2本试验证实氯丙嗪与顺铂联合用药可阻滞宫颈癌细胞hela于G1期并可诱导该细胞凋亡。3我们通过流式检测可初步推论氯丙嗪单独及与顺铂联合用药均可下调bcl-2蛋白的表达和上调Bax蛋白的表达,通过RT-PCR的试验结果进一步推测两药联合应用后下调bcl-2基因的表达和上调Bax基因的表达,从而发挥其抑制宫颈癌细胞的增殖、诱导该细胞凋亡的作用。4本试验证实了氯丙嗪这一临床常用的抗精神失常药在体外具有抑制肿瘤细胞生长的作用,与顺铂联合应用后起协同抗癌的作用,并能增加顺铂的敏感性。通过联合顺铂的研究丰富了宫颈癌的化学治疗。

论文目录

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• 研究论文氯丙嗪单独及与顺铂联合应用对宫颈癌hela 细胞生长的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 细胞凋亡相关因子研究进展
• 致谢
• 个人简历