猪肚菇疏水蛋白的提取优化及其结构和性质研究

论文摘要

本文以猪肚菇为（Clitocybe maxima）试验菌株,从其菌丝中分离纯化得到了疏水蛋白,命名为Cm.HYD。分别以甲酸提取料液比,TFA提取料液比,TFA处理时间三个因素,进行了单因素实验和正交实验,优化了提取的工艺条件。运用园二色谱仪（CD）研究了Cm.HYD在单体和聚集体时二级结构的变化。通过原子力显微镜对Cm.HYD的自组装膜的超显微形态进行了观察和测量。通过测定表面张力和水接触角研究了Cm.HYD的表面活性,同时对其起泡性,乳化性和保湿性能进行了初步的探讨。主要的研究结果如下：1.猪肚菇菌丝菌丝表面产生的疏水蛋白为典型的Ⅰ型疏水蛋白,单体分子量为5kDa。在水溶液中迅速自组装,主要形成二聚体（10kDa）。2.通过单因素实验确定了和多因素正交实验确定了提取的最佳优化工艺参数为：甲酸提取料液比（20：1）,TFA提取料液比（100：1）,TFA处理时间（6h）。可将产率提高至约0.5 mg/g。3. Cm.HYD分子在单体和聚集体状态时,二级结构会发生了明显的变化。SDS-PAGE显示,Cm.HYD单体分子量主要为5 kDa,经CD测定,其单体主要为高α-螺旋结构（在190 nnl附近有最大的正肩峰,而在215 nm处有明显的双负峰。）将单体与空气剧烈混合后,形成了组装体。SDS-PAGE显示,在20 kDa处有条带,其说明主要形成了四聚体。经CD测定,此时组装体主要为高β-折叠的结构（在195 nm处有正的肩峰,在217 nm附近有负的肩峰）。Cm.HYD单体在聚四氟乙烯（PTFE）表面吸附后,SDS-PAGE结果显示,在20 kDa处有明显条带。说明主要形成了聚体。但是经CD测定,蛋白分子中α-螺旋占的比例为41.1%,p-折叠的比例为23.2%,p-转角比例为14.4%,无规卷曲比例为25.4%。可能该蛋白处于向p-折叠转变的过渡状态。4.疏水蛋白是已知活性最强的蛋白质分子。经实验证实,Cm.HYD也具有很高的表面活性。动态表面张力实验证实,随着时间的增加,Cm.HYD可逐渐降低水的表面张力,最后达到平衡。平衡表面张力实验显示,Cm.HYD降低表面张力的能力与其浓度有着密切的关系。浓度越大,表面张力下降的越低。通过表面张力-浓度（γ-c）曲线可以得到两个关键的浓度值（c1=0.78μg/mL,c2=1.43μg/mL）,它可能反映了Cm.HYD发生界面自组装的浓度条件。水接触角实验显示,Cm.HYD在材料表面形成的自组装膜可使材料表面的可润湿性发生逆转。由亲水性转变为疏水性,反之亦然。5.经过前面相关实验研究证实,Cm.HYD确实具有高度表面活性,因此可以将其作为一种新型的绿色的表面活性剂和保湿剂。起泡性实验证实,初始泡沫高度分别是SDS的1.23倍、BSA的2.27倍。泡沫稳定性是SDS的3.17倍、BSA的1.73倍。说明Cm.HYD形成的泡沫最稳定。乳化性和乳化稳定性实验显示,Cm.HYD的乳化指数疏的乳化指数（EAI）是SDS的1.37倍、乳化稳定指数（ESI）是SDS的1.06倍。保湿性实验显示,在相对湿度20%,25℃下测定,失水率顺序为：水>Cm.HYD（100μg/mL）>甘油（10%）>Cm.HYD（300μg/mL）> Cm.HYD （500μg/mL）浓度越大,Cm.HYD溶液的保湿效果越明显。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 疏水蛋白研究概述
• 1.2 疏水蛋白的结构研究
• 1.2.1 疏水蛋白编码基因
• 1.2.2 溶解状态下疏水蛋白的结构研究
• 1.3 疏水蛋白的生理功能
• 1.3.1 真菌孢子表面的保护层
• 1.3.2 有利于形成气生菌丝和空气通道
• 1.3.3 有利于孢子的扩散与繁殖
• 1.3.4 疏水蛋白在真菌—植物的相互作用中的作用
• 1.3.5 其他生理作用
• 1.4 疏水蛋白的特殊性质
• 1.4.1 形成表面膜
• 1.4.2 形成泡沫
• 1.4.3 形成小杆层
• 1.4.4 表面吸附能力
• 1.5 疏水蛋白的潜在应用
• 1.5.1 双水相体系中的应用
• 1.5.2 蛋白质固定化
• 1.5.3 表面包被的生物材料
• 1.5.4 生物电极
• 1.5.5 表面活性剂
• 1.6 本课题的研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂和设备
• 2.2.1 实验试剂和材料
• 2.2.2 实验设备
• 2.3 培养基与溶液配制
• 2.3.1 培养基配制
• 2.3.2 溶液配制
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 猪肚菇菌丝的获得
• 2.4.2 菌丝疏水蛋白的分离纯化
• 2.4.3 疏水蛋白水溶液制备
• 2.4.4 疏水蛋白水溶液含量测定
• 2.4.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.4.6 提取工艺优化
• 2.4.7 表面张力的测定
• 2.4.8 原子力显微镜
• 2.4.9 水接触角的测定
• 2.4.10 二级结构的测定
• 2.4.11 起泡性和泡沫稳定性
• 2.4.12 乳化性和乳化稳定性
• 2.4.13 保湿性研究
• 3 结果分析
• 3.1 蛋白含量测定标准曲线
• 3.2 疏水蛋白的SDS-PAGE分析
• 3.3 提取工艺优化
• 3.3.1 甲酸提取料液比比例最佳条件的确定
• 3.3.2 TFA提取料液比最佳条件的确定
• 3.3.3 TFA处理时间最佳条件的确定
• 3.3.4 多因素正交实验
• 3.4 表面张力的测定
• 3.5 原子力显微镜
• 3.6 水接触角测量
• 3.7 二级结构研究
• 3.8 起泡性和泡沫稳定性
• 3.9 乳化及乳化稳定性研究
• 3.10 保湿性研究
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢