论文摘要
水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）引起的水稻条纹叶枯病近年来在我国广大水稻产区爆发流行,对水稻生产造成了严重损失。由于该病毒病是由介体灰飞虱（Laodelphax striatellus）以循徊增殖型方式传播,并能经卵传毒,因此防治上较为困难。为了弄清水稻条纹病毒的致病机理,本论文对RSV的几个基因进行了原核表达,并对NS3和NSvc4蛋白的功能开展了研究。利用大肠杆菌系统pET系列载体表达了RSV的NS2、NS3、NSvc4和SP基因,以Ni2+-NTA agarose亲和柱分别纯化了这四个蛋白与His组氨酸的融合蛋白并制备了相应的抗体。斑点免疫杂交表明,4个抗体均能用于检测发病的水稻叶片和带毒灰飞虱中的相应蛋白。RNA沉默是一种植物体内固有的抗病毒防卫反应,在防御病毒侵染中起重要作用。农杆菌共浸润转GFP基因本氏烟试验发现RSV编码的蛋白中只有NS3能抑制GFP基因诱导的局部沉默,并且能抑制GFP的系统沉默和沉默信号的系统传导,表明NS3蛋白为RNA沉默的抑制子。进一步用Northern和Western印迹分析证实NS3和GFP共浸润本氏烟6天后局部GFP mRNA和GFP蛋白明显增强。通过检测浸润部位siRNA的积累量发现NS3能够明显减少siRNA的积累。对NS3进行一系列突变后发现NS3蛋白的5’端和3’端都是抑制沉默所必需的。构建了GFP反向重复结构dsGFP,与GFP和NS3共浸润非转基因的本氏烟,浸润后3天NS3能抑制dsGFP诱导的局部沉默,而此时共浸润GFP与dsGFP的部位已经全部发生沉默。表明NS3能够抑制dsGFP启动的RNA沉默。利用电泳迁移率变动试验（EMSA）对NS3蛋白与单、双链RNA和siRNA的结合特性进行了分析,发现NS3蛋白能结合单链RNA（ssRNA）而不能结合双链RNA（dsRNA）,与ssRNA的结合能力随着蛋白浓度的增加而增强;NS3蛋白既能与单链siRNA结合也能与双链siRNA结合,说明了NS3蛋白作为抑制子是通过结合siRNA而阻止沉默复合体（RISC）的形成起作用的。以RSV NS3基因与GFP融合表达载体在洋葱表皮和烟草表皮细胞中对NS3蛋白的亚细胞定位进行了研究。用基因枪法将NS3与GFP融合表达载体导入洋葱表皮细胞,在共聚焦显微镜下观察发现NS3融合蛋白能在细胞质和细胞核中积累,在细胞核中积累量较高。利用农杆菌浸润法将融合表达载体在本氏烟叶片表皮细胞中进行瞬时表达,激光共聚焦显微镜观察发现NS3融合蛋白主要定位于烟草表皮细胞的细胞核内。而将预测的核定位信号序列(NLS,173KKRH176)的三个碱性氨基酸KKR突变为AAA后,突变体无法定位于细胞核中,而是主要定位于细胞质中,暗示了所预测的NLS可能是NS3蛋白的一个功能的核定位信号。用制备的NS3抗体对RSV侵染的水稻叶片中的NS3蛋白进行亚细胞定位,电镜观察发现该蛋白在健康水稻中没有积累,而在病毒侵染的水稻细胞核中表达并积累。用农杆菌介导的方法将35S启动子驱动的NS3基因转化本氏烟、普通烟和水稻,PCR和Northern印迹分析表明NS3基因已整合入这些转基因株系的基因组中,但没有发现植株生长发育出现任何异常,说明RSV NS3沉默抑制子并不是致病因子。利用基因枪将运动缺陷型PVX载体与构建的RSV编码基因表达载体共轰击本氏烟叶片,GUS染色后发现只有NSvc4能够互补运动缺陷型PVX的运动功能而在多个细胞间运动;以NSvc4与GFP的融合表达载体导入本氏烟表皮细胞,激光共聚焦显微镜下观察发现融合蛋白能够在细胞间运动,表明NSvc4是RSV编码的运动蛋白。通过基因枪轰击NSvc4与GFP的融合表达载体到洋葱表皮细胞中发现融合蛋白定位在细胞核和细胞周质中。同时用农杆菌浸润的方法将融合表达载体浸润本氏烟叶片,共聚焦显微镜下观察发现融合蛋白主要定位在细胞壁上的胞间连丝。用胶体金标记定位发病水稻叶片和转NSvc4基因水稻叶片中的NSvc4蛋白,发现NSvc4主要定位于细胞壁上,这完全符合运动蛋白的细胞定位特征,也充分说明了NSvc4是运动蛋白。利用酵母双杂交系统对NSvc4与CP间的互作进行了研究,结果发现NSvc4与CP并不能在酵母细胞中进行互作,表明CP可能不是病毒胞间运动所必需的。利用RT-PCR方法对具有黄色条纹症状的小麦条纹病样品进行了分子鉴定,用RSV几个基因的特异性引物均能扩增到特异性条带,序列分析发现扩到的三个片段（AM397832-34）分别与日本T分离物（NC003754和NC003776）的NS2、NS3和CP基因核苷酸同源性为97.3%、97.5%和97%,氨基酸同源性为99%、97.6%和98.5%。以上结果表明小麦条纹病的病原为水稻条纹病毒。