邻苯二甲酸二丁酯的酶联免疫吸附分析研究

论文摘要

邻苯二甲酸二丁酯（DBP）属于邻苯二甲酸酯类化合物的一员。主要用作硝基纤维素漆的增塑剂,也可作为聚氯乙烯和聚醋酸乙烯等塑料的增塑剂。同时是防沫剂、乳胶粘合剂以及纺织纤维润滑剂的工业原料,还可用作染料和杀虫剂的溶剂。这些材料广泛用于制造我们的日常生活用品,例如：塑料制品、油漆、胶水、驱虫剂、香水、发胶、指甲油等。DBP可在其生产或掺入到塑料、粘合剂和染料的过程中释放到环境。另外由于DBP不与终产品共价结合,随着使用时间的推移,可不断地释出进入到环境。环境中的DBP可通过呼吸、饮食以及皮肤接触等多种途径进入人体。近年来,DBP被认为是一种环境内分泌干扰物,具有生殖毒性、发育毒性以及潜在的致癌性等。为了更好测定DBP在环境中的污染水平以及评价暴露于环境中的DBP产生的潜在不利影响,必须建立一种快速、简便、灵敏、费用低廉的方法检测DBP在环境和生活用品中的残留量。目前国内外对DBP的监测方法主要有气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱法（HPLC）等技术,但这些分析方法对仪器条件要求高,前处理的操作过程相对复杂、耗时。免疫分析特别是酶联免疫吸附分析（ELISA）由于不需要昂贵的仪器设备,且特异性强、灵敏度高、操作简便快捷,在现场筛选和大量样本的快速检测中显示了其独特的优势。本研究以4-硝基邻苯二甲酸和正丁醇为原料,经过酯化、还原合成了具有DBP结构特征的半抗原4-氨基邻苯二甲酸二丁酯（DBAP）。用重氮化法将DBAP与卵清蛋白（OVA）和牛血清白蛋白（BSA）偶联得到人工抗原DBAP-OVA和DBAP-BSA。用DBAP-OVA免疫BALB/c小鼠获得了高效价、高灵敏度的抗血清。利用淋巴细胞杂交瘤技术制备并筛选出了1株能稳定分泌抗DBP抗体的杂交瘤细胞株DBP-4E9,其染色体数目为96～105条,分泌抗体的亚型为IgG1。小鼠腹水法大量制备的DBP单抗经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化,纯度为91.1%,回收率为68.3%。基于此单抗的ELISA最适检测条件是：以1%OVA作封闭剂；竞争反应体系为含10% DMF、1.6% NaCl、0.1% BSA的0.01 mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液；25℃竞争反应1.5h。建立的人工抗原包被间接竞争ELISA在包被抗原DBAP-BSA浓度为0.25μg/mL,单抗工作浓度为62.5 ng/mL时,对DBP的线性检测范围是11.56～863.72μg/L,最低检测限（LD）为（9.21±1.28）μg/L。此外还建立了一种新颖的半抗原包被间接竞争ELISA检测DBP的含量。首先用酸性高锰酸钾将聚苯乙烯酶标板表面氧化衍生出羧基,再将半抗原DBAP通过水溶性碳二亚胺（EDC）共价交联到羧化的聚苯乙烯酶标板上。在DBAP包被,单抗工作浓度为500 ng/mL时,此法灵敏度比人工抗原包被间接竞争ELISA提高了10倍,线性检测范围是2.16～155.92 gg/L,LD可达（0.93±0.20）μg/L。所获得的DBP单抗除了与邻苯二甲酸丁基苄酯（BBP）和半抗原DBAP有一定的交叉反应（分别为21.5%和27.1%）,而与其它常用的几种邻苯二甲酸酯类化合物均无交叉反应。用所建立的半抗原包被间接竞争ELISA对自来水和东湖水样进行的DBP添加回收试验结果显示,回收率分别为90.5～102.7%和92.4～100.5%。检出某品牌食品保鲜袋、一次性塑料杯和指甲油中DBP含量分别为（1.60±0.22） mg/kg、（1.91±0.21） mg/kg和（0.43±0.03） mg/kg。检测灵敏度和准确性可以满足水环境中DBP的残留检测要求,并可用于塑料制品和化妆品中DBP含量的检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 绪论
• 1.1 邻苯二甲酸二丁酯的性质及应用
• 1.2 邻苯二甲酸二丁酯的残留和人群暴露
• 1.3 邻苯二甲酸二丁酯的危害
• 1.4 邻苯二甲酸酯类化合物的检测方法
• 1.4.1 色谱法
• 1.4.2 免疫分析法
• 1.5 有机小分子酶联免疫吸附分析技术
• 1.5.1 人工抗原的制备
• 1.5.2 抗体的制备
• 1.5.3 有机小分子酶联免疫吸附分析的类型
• 1.6 选题的目的及意义
• 2.材料与方法
• 2.1 材料、试剂及仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要溶液
• 2.1.4 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 半抗原的合成及结构鉴定
• 2.2.2 人工抗原的合成及结构鉴定
• 2.2.3 BALB/c小鼠免疫
• 2.2.4 抗血清效价的测定
• 2.2.5 抗血清灵敏度的测定
• 2.2.6 单克隆抗体的制备
• 2.2.7 杂交瘤细胞染色体分析
• 2.2.8. 单克隆抗体的亚型分析
• 2.2.9 单克隆抗体的纯化
• 2.2.10 人工抗原包被ELISA检测方法的建立与优化
• 2.2.11 半抗原包被的间接竞争ELISA检测方法的建立
• 2.2.12 单抗特异性分析
• 2.2.13 水样中DBP的添加回收试验及检测
• 2.2.14 消费品中DBP含量的检测
• 3. 结果
• 3.1 半抗原结构的鉴定
• 3.2 人工抗原结构的鉴定
• 3.2.1 紫外光谱
• 3.2.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.3 抗血清效价
• 3.4 抗血清灵敏度
• 3.5 杂交瘤细胞株的建立
• 3.6 杂交瘤细胞染色体分析
• 3.7 单克隆抗体亚型分析
• 3.8 单克隆抗体的纯化
• 3.9 人工抗原包被ELISA检测条件的优化
• 3.9.1 最适包被抗原浓度和抗体工作浓度的确定
• 3.9.2 竞争反应温度的确定
• 3.9.3 有机溶剂的种类及含量的影响
• 3.9.4 竞争反应体系pH的影响
• 3.9.5 竞争反应体系离子强度的影响
• 3.9.6 竞争反应体系去污剂含量的影响
• 3.9.7 封闭剂的选择
• 3.9.8 人工抗原包被的间接竞争ELISA检测方法的建立
• 3.10 半抗原包被的间接竞争ELISA检测方法的建立
• 3.10.1 最适包被半抗原浓度和单抗工作浓度的确定
• 3.10.2 半抗原包被的间接竞争ELISA标准曲线的建立
• 3.11 单抗特异性分析
• 3.12 水样中邻苯二甲酸二丁酯的添加回收率
• 3.13 消费品中邻苯二甲酸二丁酯含量的检测
• 4. 讨论
• 4.1 邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的合成
• 4.2 免疫方案
• 4.3 单克隆抗体的制备
• 4.3.1 骨髓瘤细胞的制备
• 4.3.2 杂交瘤细胞的选择培养
• 4.3.3 单克隆抗体纯化方法
• 4.4 反应条件对间接竞争ELISA的影响
• 4.5 半抗原包被ELISA
• 4.6 单克隆抗体的特异性
• 4.7 邻苯二甲酸二丁酯的ELISA检测
• 5. 结论与展望
• 6. 参考文献
• 附录1 主要英文缩写词
• 附录2 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢