人剪切修复基因XPD对肝癌细胞生长抑制的研究

论文摘要

目的研究表明,人剪切修复基因着色性干皮病基因D （Xeroderma Pigmentosum D,XPD）作为重要的DNA修复路径----核苷酸切除修复中的关键因子,在DNA修复路径中起着重要的作用。XPD基因发生突变时,肿瘤易感性更高。本实验研究野生型XPD基因对肝癌细胞生长的影响,探讨XPD基因抑制肝癌细胞生长的机制。方法用碱裂解法提取空载质粒pEGFP-N2和重组质粒pEGFP-N2-XPD,提取出的质粒以KPNⅠ、BGIⅡ和SPHⅠ酶切鉴定。实验分三组,重组质粒XPD-N2、空载质粒N2,并用与XPD-N2、N2具有相同遗传背景和代数的SMMC-7721细胞作为空白对照。用脂质体转染法瞬时转染三组细胞。荧光显微镜下观察转染后绿色荧光蛋白报告基因表达情况。提取各组细胞总RNA,合成cDNA,用聚合酶链反应（PCR）检测三组细胞中XPD、c-myc、cdc25A、cdK2表达情况。使用蛋白抽提液分别提取三组细胞的总蛋白,使用全自动生化分析仪测定蛋白浓度,Western blot法检测细胞中XPD、c-myc、cdc25A、cdK2表达量变化。流式细胞仪器检测细胞周期,分析细胞各周期的百分率。在96孔板中进行三组细胞的转染, MTT法观察细胞增殖的活力。结果1、提取出的重组质粒pEGFP-N2-XPD用酶切鉴定,与Genebank中公布的人类XPD完整mRNA序列NM000400相吻合。2、转染质粒后40h,在荧光显微镜下,可以在SMMC-7721- pEGFP-N2,SMMC-7721- pEGFP-N2-XPD中观察到绿色荧光蛋白的表达。3、RT-PCR、Western blot检测发现SMMC-7721- pEGFP-N2-XPD细胞与SMMC-7721- pEGFP-N2和SMMC-7721两对照组相比,其XPD表达明显增高;c-myc、cdc25A、cdK2相对表达量明显减少,差异有统计学意义。4、流式细胞仪结果显示:与其它二组相比,转染了pEGFP-N2-XPD重组质粒的肝癌SMMC-7721细胞进入S期发生障碍,停滞在G1期。5、MTT检测示:与两对照组相比,SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞增殖率明显减弱（P<0.05）。结论野生型XPD基因可以抑制肝癌细胞的生长,XPD基因可抑制c-myc、cdc25A、cdK2基因的表达。而且野生型XPD基因也通过抑制cdK2的表达作用于S期DNA损伤检控点,从而抑制肝癌细胞增殖。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法和步骤
• 第3章 结果
• 3.1 pEGFP-N2-XPD 质粒鉴定
• 3.2 pEGFP-N2-XPD 转染成功鉴定
• 3.3 三组细胞内XPD、c-myc、cdc25A、cdK2 m RNAs 表达量的情况
• 3.4 三组细胞内XPD、c-myc、cdc25A、cdK2 蛋白表达量的情况
• 3.5 pEGFP-N2-XPD 重组质粒对SMMC-7721 细胞周期的影响
• 3.6 pEGFP-N2-XPD 重组质粒对SMMC-7721 细胞增殖活力的影响
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 综述1,发表在《国际消化病杂志》
• 综述2,发表在《医学分子生物学杂志》
• 综述3,发表在《新医学》
• 综述4,发表在《医学分子生物学杂志》
• 综述5,发表在《肿瘤防治研究》
• 攻读学位期间的研究成果