双色荧光正相杂交检测SNP动力学初探及复杂疾病易感基因的关联分析和Meta-分析

论文摘要

基于芯片的双色荧光正相杂交检测SNP技术可以在一张芯片上针对同一SNP位点实现检测个体数目的高通量，该技术特别适用于某些已知的候选SNP位点与某种疾病的大样本关联分析。但是有关该技术的杂交动力学研究目前还没有报道。本研究考察了信号值（Cy3，Cy5）和Ratio值（Cy5／Cy3）与PCR产物点样浓度、PCR产物长度和荧光标记探针长度之间的关系，从而探讨PCR产物点样浓度、PCR产物长度和荧光标记探针长度对SNP分型的影响。研究结果表明，（1）Cy5、Cy3信号值随点样PCR产物浓度的增加而增加，与理论结果吻合；而三种基因型Ratio值呈现规律变化趋势，进一步研究后发现，这是由于两种染料性质的偏差引起的，导致低信号时Cy5杂交动力学敏感性高于Cy3，在采用正反标记试验校正染料带来的系统误差后，三种基因型Ratio值随点样PCR产物浓度的增加而保持稳定。（2）发现当点样探针为双链时，Cy5、Cy3信号值随PCR产物长度的增加而明显下降，Ratio值区分能力也逐渐降低，而当点样探针为单链时，则信号值随长度没有明显变化。（3）随着荧光标记的寡核苷酸分子长度的增加，Ratio值区分能力明显下降，当探针长度超过20bp长度时，已经基本没有区分能力。我们建议利用双色荧光标记正相杂交检测SNP技术进行基因分型时，对同一批分型样本，分别做正反标试验，计算校正后的Ratio值，有利于提高分析结果的稳定性和准确性；在双链点样的情况下，PCR产物的长度不易太长，对于长片断PCR产物使用单链点样，可以提高信号值的强度，而不影响基因分型的能力。采取适当的PCR产物点样浓度、PCR产物长度和荧光标记探针的长度，并采用正反标记试验，可以取得稳定、准确的基因分型效果。利用我们建立的正向杂交技术来研究Graves’病（Graves’disease，GD）的易感性。作为抑制T淋巴细胞活化的重要分子，CTLA-4是甲状腺自身免疫性疾病的重要候选易感基因。甲状腺球蛋白基因（Thyroglobulin，TG）被认为是继HLA和CTLA-4后的第三个GD易感候选基因，但是关联分析结果存在矛盾，还有待于在各人群中验证。CTLA-4与GD相关性研究结果也仍存在分歧，真正的致病性多态位点还没有确定。关于CTLA-4 5’和3’端转录调控区的SNP位点的研究比较少，在中国汉族人群中更是鲜有报道。对于CTLA-4基因，本研究除了选取第一外显子中+49位G／A位点之外，还选取了启动子区域的三个SNP（-1722A／G，-1661 A／G，-318C／T）以及3’UTR CT60位点；对于TG基因，我们选取了在高加索人群中曾有报道正相关的两个SNP（rs180223和rs11535853），针对以上候选SNP位点，我们在中国汉族人群中对GD进行单位点关联分析和单倍型关联分析，调查这些位点在中国汉族人群中与GD的关系。单位点关联分析结果表明-1661A／G、+49A／G、CT60以及rs11535853位点与GD发病显著性相关，并且发现风险等位基因+49G和rs11535853C以隐性遗传模式发挥作用，提示这两个等位基因具有剂量效应（dose effect）；对于-1661A／G和CT60A／G位点，我们发现其易感等位基因G在女性群体中与GD关联强度明显高于男性群体，提示这两个位点与GD的关联可能具有性别效应。通过单倍型分析，我们发现了CTLA-4两种高风险致病性的单倍型，其关联强度明显高于单个位点的分析结果，提示多态位点之间可能存在交互作用。其中，风险最高的单倍型是1722G～-1661G～-318C～+49G～CT60G，该单倍型恰好包括单点分析中的3个显著性关联的位点：1661G，+49G和CT60G，另外-318C等位基因在功能实验中证实其可以降低CTLA-4的表达量，所以导致抑制T细胞功能减弱，因此怀疑也与自身免疫性疾病相关。单倍型效应明显强与单个位点分析结果或者其简单加和效应，提示几个微弱效应的多态位点联合在一起可以导致疾病易感性的急剧放大。大约50％的GD患者伴有Graves’突眼（Graves”ophthalmopathy，GO），GO也被认为是一种复杂的自身免疫性疾病，目前关于GO的遗传易感性的调查比较少，CTLA-4是重要的候选基因之一。然而，大多数研究调查的位点主要集中在一号外显子的+49A／G位点，并且研究结果之间有很大的争议。本研究中，我们将GD患者依据有无明显的突眼症状分为两组（GO和non-GO），调查以上的七个SNP位点与GD病人发生GO易感性的关系。结果表明在调查的七个SNP位点中只有CTLA-4启动子区域的-318C／T位点与GO显著性相关，等位基因T在GD病人中对GO的发生有保护作用。不同位点组合的单倍型分析结果进一步支持单位点分析结果，只有包含-318C／T位点的单倍型才与GO显著性相关。Meta-分析（Meta-analysis）可以有效解决关联分析中由于样本量不足而导致的统计效力较低的缺陷，另外也可以发现研究之间异质性的来源，目前在基因和复杂疾病易感性之间关系的研究方面应用非常广泛。本研究利用Meta-分析对几个比较有争议的关联分析进行系统评价，得出了比较有意义的结论：1)CTLA-4 exon-1 +49A／G多态性与Graves’突眼的meta-分析。我们发现+49G等位基因在欧洲人群中与GD病人发生GO易感性显著性相关，而在亚洲人群中利用现有的文献基础，我们没有发现这种关联性；2)CTLA-4 exon-1+49A／G多态性与RA的meta-分析。我们发现+49G等位基因在亚洲人群中与RA显著性相关，而在欧洲人群中没有；3)XRCC3基因多态性与肿瘤易感性的Meta-分析。我们的分析结果支持XRCC3是某些肿瘤类型易感性的一个微效基因，尤其是对于乳腺癌和非黑色素瘤皮肤癌。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 双色荧光正相杂交检测SNP技术的建立
• 第一节 前言
• 第二节 实验材料和方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论
• 第二章 中国人群中候选基因多态性与Graves'病的关联分析
• 第一节 前言
• 第二节 实验材料和方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论
• 第三章 Meta-分析在复杂性疾病关联分析中的应用
• 第一节 Meta-分析概述
• 第二节 CTLA-4 exon-1 +49A/G多态性与Graves'突眼的meta-分析
• 第三节 CTLA-4 exon-1 +49A/G多态性与RA的meta-分析
• 第四节 XRCC3多态位点与肿瘤易感性的meta-分析
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的论文
• 致谢