稗草成熟胚愈伤组织诱导和植株再生及龙须草转化体系建立的主要影响因素分析

论文摘要

稗属（Echinochloa）植物为一年生或多年生禾本科草本植物,具有分蘖力强、适应性广、长势旺、根系发达、吸肥力强等特点,并且为C4植物,具有高光合特性。因此,稗草是水稻、小麦等粮食作物在抗逆性和丰产性育种中可利用的重要种质资源。虽然由于物种间的生殖隔离导致稗草和粮食作物的杂交障碍,但通过生物技术手段利用稗草资源是一条可行的途径,而建立稗草离体再生体系是进一步利用稗草资源的基础。本文以分布于我国吉林磐石、浙江天目山、江苏南京、云南大理、湖北武汉的6个稗草居群的成熟种子作为外植体,研究影响其成熟胚愈伤组织诱导和分化的几种因素,筛选出适宜的稗草基因型和培养条件,建立了稗草离体再生体系。为将来稗草和水稻等作物的细胞融合奠定技术基础,为稗草在作物育种中的应用提供参考。主要研究结果如下：1.愈伤组织诱导适宜的稗草居群筛选：以6个居群的稗草成熟种子为外植体,在含3mg/L2,4-D的诱导培养基上诱导愈伤组织,结果表明,磐石02居群优愈率最低仅为5.38%,武汉居群获得状态较好的胚性愈伤组织,优愈率为50.3%,表明在本研究中武汉居群是最适宜诱导愈伤组织的材料。2.稗草愈伤组织的诱导：以武汉居群的稗草成熟种子为外植体,筛选愈伤组织诱导的适宜2,4-D浓度。结果表明,添加1-6mmg/L2,4-D,稗草愈伤组织的诱导率均较高,可达80%左右,但在添加3mg/L 2,4-D的培养基上,其诱导的愈伤组织状态较好,能够得到较多的胚性愈伤组织。3.基本培养基对稗草愈伤组织状态的影响：在MS和N6两种基本培养基上,愈伤组织生长状态有差异,在N6基本培养上诱导的愈伤组织状态优于MS培养基,能够得到淡黄色、较干燥的颗粒状愈伤组织。4.凝固剂对稗草愈伤组织状态的影响：在植物凝胶作为凝固剂的培养基中,愈伤组织较干燥,并且形成的颗粒性胚性愈伤较多；而在以琼脂粉为凝固剂的培养基上,稗草愈伤组织基部较多粘稠物质,较湿软并且颗粒性胚性愈伤组织较少。5.愈伤组织分化培养基的筛选：在所设计的8种分化培养基上,武汉居群愈伤组织分化率都比较低,其中具有最高分化率（8.57%）的培养基为MS+0.2mg/L NAA+ 1.5mg/L 6-BA+1g/L CH。龙须草（Eualiopsis binata）是禾本科一种高度兼性无融合生殖植物,具有孢子体无减数胚囊发育、胚和胚乳不受精形成种子的无融合生殖特性,在禾谷类作物杂种优势利用上具有潜在应用价值。为深入研究龙须草无融合生殖遗传调控机理,需要建立一个稳定的龙须草遗传转化体系。本研究以3个龙须草居群的成熟种子为外植体,优化了龙须草成熟种子离体再生体系,进而,以成熟种子诱导的胚性愈伤组织作为转化受体,研究了影响根癌农杆菌介导龙须草转化的主要因素,为建立稳定的龙须草转化体系打下一定基础。主要研究结果如下：1.龙须草离体再生体系的优化：降低生根培养基蔗糖浓度至20g/L,20个组培苗生根效率达到100%,并且移栽后均成活；改用NAA继代愈伤组织,并没有改善愈伤组织的状态；而改用植物凝胶作凝固剂,对愈伤组织的状态改善有一定的作用,得到更多较好的胚性愈伤组织。2.龙须草转化过程中的相关因素分析：来自星子、西峡、丹江的三个龙须草居群中,星子居群的愈伤组织最适合作为转化的受体,在同等条件下星子居群的报告基因GFP瞬间表达率最高；共培养过程中提高培养基中2,4-D的浓度至5mg/L,能够显著促进转化；在农杆菌浸染OD600为0.6、侵染45min、共培养3天时,可获得较高瞬间表达率（40%）,抗性愈伤率可达42.32%；降低无机盐的浓度为1/4MS时,瞬间表达率达42.43%；培养基中添加一定量的水解酪蛋白（CH）也有利于转化。

论文目录

• 摘要
• Abstracts
• 缩略词表
• 第一章 稗草成熟胚愈伤组织诱导和植株再生
• 1 前言
• 1.1 稗草研究概述
• 1.2 植物组织培养的主要影响因素
• 1.2.1 基因型
• 1.2.2 外植体
• 1.2.3 培养基
• 1.2.4 培养条件
• 1.3 研究目的与意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 种子处理
• 2.2.2 愈伤组织的诱导、继代及分化
• 2.2.3 数据统计
• 3 结果和分析
• 3.1 稗草种子消毒时间的确定
• 3.2 居群间愈伤组织诱导率的差异
• 3.3 外植体的选择
• 3.4 2,4-D浓度对愈伤组织诱导和生长状态的影响
• 3.5 基本培养基对稗草愈伤组织生长的影响
• 3.6 凝固剂对稗草愈伤组织生长的影响
• 3.7 激素组合对稗草愈伤组织分化的影响以及植株移栽成活
• 4 讨论
• 4.1 2,4-D浓度对稗草成熟种子胚性愈伤组织诱导的影响
• 4.2 基本培养基对稗草愈伤组织状态的影响
• 4.3 植物凝胶对稗草愈伤组织状态的影响
• 第二章 龙须草转化体系建立的主要影响因素分析
• 1 前言
• 1.1 龙须草研究概况
• 1.2 根癌农杆菌介导的植物转基因概述
• 1.2.1 根癌农杆菌生物学特性
• 1.2.2 根癌农杆菌介导法
• 1.2.3 影响根癌农杆菌介导植物转基因的主要因素
• 1.2.3.1 高效稳定的组织培养体系
• 1.2.3.2 农杆菌菌株和质粒
• 1.2.3.3 基因活化的诱导物
• 1.2.3.4 共培养
• 1.2.3.5 筛选方案
• 1.2.3.6 干燥处理
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 实验菌株和质粒
• 2.1.3 实验所用培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验试剂的配制
• 2.2.2 愈伤组织的准备
• 2.2.3 再生苗的生根优化
• 2.2.4 凝固剂对愈伤组织状态的影响
• 2.2.5 NAA对愈伤组织状态的影响
• 2.2.6 农杆菌的活化和培养
• 2.2.7 农杆菌侵染浓度和时间对GFP瞬间表达的影响
• 2.2.8 不同龙须草居群对GFP瞬间表达的影响
• 2.2.9 共培养时间对转化的影响
• 2.2.10 农杆菌悬浮液和共培养基中2,4-D浓度对GFP瞬间表达的影响
• 2.2.11 无机盐等对转化的影响
• 2.2.12 数据统计
• 3 结果和分析
• 3.1 再生苗的生根优化
• 3.2 凝固剂以及NAA对愈伤组织状态的影响
• 3.3 龙须草居群、农杆菌悬浮液和共培养基2,4-D对GFP瞬间表达的影响
• 3.4 农杆菌侵染浓度和时间对GFP瞬间表达和抗性愈伤率的影响
• 3.5 共培养时间对GFP瞬间表达及抗性愈伤率的影响
• 3.6 无机盐等对GFP瞬间表达的影响
• 3.7 抗性愈伤组织的分化
• 4 讨论
• 4.1 高效稳定的离体再生体系是龙须草转化体系建立的基础
• 4.2 居群对龙须草转基因的影响
• 4.3 农杆菌菌液浓度和侵染时间对龙须草转基因的影响
• 4.4 培养基中2,4-D浓度对龙须草转基因的影响
• 4.5 筛选方案的确定对转化效率的影响
• 4.6 结论和展望
• 参考文献
• 致谢