论文摘要
恶性肿瘤是威胁人类健康的常见病及多发病,对恶性肿瘤的早期、特异性诊断是提高生存率、改善生活质量的关键所在。传统的影像诊断方法主要针对肿瘤形成实质性肿块后成像,但此时患者已经处于临床中晚期阶段,疗效不佳,预后差。寻找一种能早期、特异性诊断肿瘤的新方法,一直是国内外医药工作者追求的目标。兴起于上世纪末的分子影像学（Molecular imaging）,着眼于采用影像的手段非侵入性地对活体内参与生理和病理过程的分子进行定性或定量可视化观察,在早期、特异性诊断恶性肿瘤方面有着极其巨大的应用和开发前景。在分子成像研究中,制备特异性高、亲和力好的靶向探针是实现活体分子成像的关键因素。本课题将分子生物学中的反义基因技术用于影像医学领域,构建分子探针:以c-erbB2癌基因的mRNA片段作为靶点,制备与该序列互补的反义寡脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides,ASODN）,利用超顺磁性氧化铁（superparamagnetic Iron Oxide, SPIO）标记于ASODN,制成反义探针。由于引入体内的探针能按碱基互补原则与癌基因的mRNA互补结合,故能特异地分布在癌基因扩增和过度表达的肿瘤组织中,采用磁共振（magnetic resonance,MR）成像,可望显示出肿瘤的存在和大小。可见,反义基因显像技术可以检测出只有癌基因扩增和过度表达、还没有形成实体的肿瘤组织,因此可以达到早期、特异性诊断肿瘤的目的。实验中选择c-erbB2癌基因作为研究的靶基因,是因为该癌基因是neu基因在人类的同源基因,其扩增和表达只限于恶性肿瘤组织。除此之外,该基因还与肿瘤组织的病理分级、淋巴结转移、临床分期密切相关,并常作为临床化疗方案选择、预后判断的主要指标。因此该基因为靶向诊断提供了良好的位点,它一旦出现扩增和过度表达,都会使细胞mRNA的含量增加,相应提供出结合的靶向位点也同样增加。由于生长旺盛的肿瘤细胞膜上存在着大量的转铁蛋白受体,容易将含SPIO的反义探针导入肿瘤细胞内,提高了细胞顺磁性物质含量;通过MR扫描,便于得到解剖结构清晰、信噪比高、对比度好的图像。MR具有成像时间窗长、空间与时间分辨力高、图像对比度好等优点,是理想的分子影像学检测设备。但是,MR最大的缺点是对信号探测的敏感性较低,一般只能检测到组织中μmol级的顺磁性物质含量。要实现对癌基因表达的MR可视化检测,必须针对肿瘤形成过程中的关键分子标记顺磁性载体。常用的顺磁性载体物质SPIO,具有磁力矩,在磁场中单个磁力矩沿着磁场自由排列,导致质子T2去相位驰豫加速,组织T2加权像信号显著降低,能明显增加组织之间的信号差别;在去掉外加磁场后,其磁性迅速消失,呈现超顺磁性特点。此外,SPIO还具有毒副作用小等优点,广泛应用于示踪活体干细胞（如神经干细胞、胚胎干细胞和间充质干细胞等）等研究领域,是一种较理想、安全的对比剂或分子载体。但是,SPIO直接注入体内后,大多聚集在网状内皮系统如肝、脾及淋巴结内,对其他器官或肿瘤组织的靶向性不强。如何实现组织器官的主动靶向显影,一些研究方向包括采用SPIO标记单克隆抗体、特异性蛋白、质粒DNA等大分子物质,而标记ASODN则未见国内外文献报道。方法:第一部分SPIO的制备与检测目前国外已有部分商业化的SPIO面市,但这些产品不仅在国内市场上难觅踪影,价格昂贵,粒径从几十到几百纳米不等,而且使用的表面活性剂也各不相同,对于开展具有知识产权的创新性研究十分不利。我们采用共沉淀法制备纳米级SPIO,重点对样品的表征、磁学参数、急性毒性作用、稳定性等方面进行检测,为进一步将其作为基因载体奠定基础。1.物理性状:应用X射线粉末衍射法、透射电镜、原子力显微镜测定样品的主要成分、粒径。2.磁学参数:振动样品磁强计及1.5 T超导型MR仪测定样品的饱和磁化强度、剩磁、驰豫率等。3.急性毒性作用:90只小鼠随机分为口服灌胃、静脉注射、腹腔注射组（n=30）,分别按总剂量2104.8 mg/kg、给药容积40 ml/kg口服灌胃;总剂量438.5 mg/kg、给药容积25 ml/kg静脉注射;以及总剂量1578.6 mg/kg,给药容积30 ml/kg腹腔注射;各组另设10只小鼠按相应方式给予等量生理盐水作为对照。给药后饲养14天,观察小鼠的一般情况及主要脏器的病理学改变,检测血清主要生化指标。4.稳定性考察:参照一般注射试剂的基本要求,对样品分别进行强化实验和长期实验,观察或测定样品的性状、pH值、铁浓度、粒径、饱和磁化强度及T2磁豫率等参数。第二部分SPIO标记的c-erbB2癌基因反义探针制备及质量考察1.探针制备:人工合成针对c-erbB2 mRNA 5’端转录起始位的ASODN片段,及相应的正义及无义片段（序列）,采用化学交联法分别将SPIO标记于相应的寡脱氧核苷酸片段上。2.探针物理及磁学参数、生物性状考察:原子力显微镜观察表征,高效液相凝胶色谱法检测联接率和生物活性;聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测稳定性;1.5 T超导型MR仪及振动样品磁强计测定磁学参数。3.急性毒性作用:采用最大给药量法,60只清洁级昆明种小鼠随机分为口服灌胃、静脉注射、腹腔注射组,分别按总剂量为2104.8mg/kg,给药容积40ml/kg口服灌胃;总剂量为438.5mg/kg,给药容积25ml/kg静脉注射;以及总剂量为1578.6mg/kg,给药容积30ml/kg腹腔注射;各组还另设20只小鼠按相应方式给予等量生理盐水作为对照。所有实验小鼠均在25℃室温下连续饲养14天,观察并记录饲养期间小鼠的一般情况、主要脏器的病理学、血常规、凝血指标和血清主要生化指标改变。4.放置后稳定性考察:样品在4±1℃冰箱中放置3月,观察或测定性状、pH值、铁浓度、粒径、饱和磁化强度及T2磁豫率等参数。第三部分SPIO标记的c-erbB2癌基因反义探针兔药代动力学参数测定及小鼠体内分布、排泄1.兔药代动力学:大白兔15只,体重2.0±0.4kg,随机分为小剂量、中剂量及大剂量3组,每组均经左侧耳缘静脉注射反义探针,浓度分别为3mg/kgFe（小剂量）、6mg/kgFe（中剂量）、12mg/kgFe（大剂量）,分别在注射前、注射后1min、3min、5min、10min、20min、40min、60min、120min、180min、360min、720min从右侧耳缘静脉采血0.5ml,原子吸收光谱法测定血液中铁浓度,用3P97软件拟合曲线方程,计算半衰期、药时曲线下面积、清除速率和血浆蛋白结合率。2.小鼠体内分布:BALB/c小鼠尾静脉给予12ml/kgFe剂量的反义探针,于给药后1min、10min、30min、60min、180min、360min这6个时间点作MR扫描,测定心、肝、脾、肾、肌肉的信噪比;MR扫描之后处死动物,取心、肝、脾、肺、肾、肌肉,测定铁含量。3.反义探针的排泄:BALB/c小鼠5只,分别装入代谢笼中饲养,先收集给探针前24h的尿液及粪便,测定铁含量作为本底。之后分别由尾静脉给予3.76ml/kgFe剂量的反义探针,于注射后0～24h、24～48h收集尿液和粪便,测定铁含量。第四部分反义探针体外转染高表达c-erbB2癌基因的SK-Br3肿瘤细胞株1.探针转染后对SK-Br3肿瘤细胞株的生物学特性影响:MTT法及台盼蓝排除实验测定对细胞活力的影响;RT-PCR半定量分析对c-erbB2基因mRNA表达的影响;Western blot测定对c-erbB2蛋白表达的影响。2.探针转染细胞的特异性:通过原子吸收光谱法测定细胞中铁含量,光学显微镜及透射电子显微镜观察细胞内铁分布等手段,并设置反义探针转染不表达c-erbB2癌基因的Fuda肿瘤细胞株,以及正义和无义探针转染SK-Br3肿瘤细胞株、SPIO及ASODN转染SK-Br3肿瘤细胞株作对照,来观察反义探针转染SK-Br3肿瘤细胞株的特异性。3.体外MR成像:选择反义探针转染SK-Br3肿瘤细胞株为研究对象,以正义探针和无义探针转染的SK-Br3肿瘤细胞株、反义探针转染Fuda肿瘤细胞株、SPIO及ASODN转染SK-Br3肿瘤细胞株、蒸馏水作为对照。以上7组分别置入Ependoff管,3英寸表面线圈固定,MR行横断位扫描,扫描参数:GRE序列,TR/TE 225/5.3ms,翻转角30°,视野16.0mm,层厚1.8cm,矩阵256×128。第五部分SPIO标记的c-erbB2癌基因反义探针用于活体磁共振基因成像1.构建荷瘤裸鼠模型:选取5～6周龄及体重12g～18g的裸鼠,于右后肢内侧腋窝皮下接种对数生长期的SK-Br3细胞株,15天后即可成功建模。另外,采用同样的方法构建5只Fuda细胞株裸鼠荷瘤模型作为对照。2.确定反义探针剂量及MR扫描时间:根据预实验及反义探针在大白兔体内分布的药-时曲线图,反义探针在荷瘤裸鼠的MR活体成像剂量为12ml/kgFe,并确定MR扫描的时间点分别在注射反义探针后的10min、30min、60min、180min、360min。3.MR扫描序列与参数包括:①T1WI SE序列TR/TE 400/13 ms,激发次数6;②T2 WI FSE序列TR/TE 2500/40ms,激发次数2;③T2* WI SE序列TR/TE 2000/80ms,激发次数2;④T2* FSPGR序列TR/TE 130/9ms,激发次数2,翻转角6°。分别行横断位及冠状位扫描,层厚4mm,层距1mm,矩阵256×222,视野10cm。4.MR图像分析:观察全部荷瘤裸鼠的肝、脾、心、肾、肌肉及肿瘤组织信号强度变化并测定信噪比（取值范围至少包含50个像素）,绘制时间-信号曲线。5.病理学检测:在完成每个时间点的扫描后,处死动物并取出肝、脾、心、肾、肌肉及肿瘤组织,HE及普鲁士蓝染色,光镜下观察。结果:第一部分SPIO的制备与鉴定1.采用共沉淀一步法成功制备外包葡聚糖的SPIO,所得样品成分为四氧化三铁晶体。透射电镜显示葡聚糖包被的SPIO核心部分即铁粒子外形主要为球形,分布比较均匀,粒径不超过5 nm,不能显示葡聚糖包被后的整个粒径;而高精度原子力显微镜显示葡聚糖包被的SPIO呈立方体形,颗粒均匀,核心铁粒子直径在5 nm内,葡聚糖包被后的实际粒径在20～35 nm之间。2.样品的T 2弛豫率为0.155×106mo l-1·sec-1,饱和磁化强度为694.2162emu/g Fe,比饱和磁化强度683.9568emu/g,比剩余磁化强度为30.4648emu/g,剩磁为21.46374Gs,磁化曲线显示样品具有超顺磁性,并与文献记载的国外产品磁学性能十分相近。3.观察期间各组小鼠均未见死亡;各组小鼠血清生化指标无显著差异;H-E染色及Wright骨髓染色显示各组小鼠肝、脾、肾、心、肺和骨髓细胞均无水肿、变性、坏死等改变;普鲁士蓝染色发现给药组小鼠肝、脾内分布少许铁蓝色颗粒,而对照组未见。4.在强化实验和长期实验条件下,样品的性状、pH值、铁浓度、粒径、饱和磁化强度及T2磁豫率等参数,与实验前所检测的数据无统计学差异。第二部分SPIO标记的c-erbB2癌基因反义探针制备及质量考察1.原子力显微镜能观察到c-erbB2癌基因反义探针的化学结构,其颗粒整齐、均匀,排列规则,相互之间可以分开,表面形貌高低起伏,呈立方体形,粒径在25～40 nm之间。2.高效液相凝胶色谱法检测探针联接率为99%,仍保持原有生物活性;聚丙烯酰胺凝胶电泳法显示探针的稳定性良好。3.1.探针的T2弛豫率为0.156×106mo l-1·sec-1,磁化强度为69.4238emu/g Fe,比饱和磁化强度68.4134emu/g,比剩余磁化强度为30.3541emu/g,剩磁为19.7345Gs。3.在观察期间,各组小鼠均未出现死亡,仅个别出现食欲下降、饮水量增多、腹泻、嗜睡、活动增加等,均在3日内恢复正常。脏器系数无统计学差别,肝、脾、肾、心、肺、骨髓等主要脏器颜色、形态未见明显异常改变,H.E染色切片肝、脾、肾、心、肺等细胞和Wright染色的骨髓细胞均无水肿、变性、坏死等改变,仅肝、脾内分布少许蓝色铁颗粒。各组血常规、凝血指标及生化指标无统计学差异。4.在4±1℃放置3月,样品的性状、pH值、铁浓度、粒径、饱和磁化强度及T2磁豫率等参数,与实验前所检测的数据无统计学差异。第三部分SPIO标记的c-erbB2癌基因反义探针兔药代动力学参数测定及小鼠体内分布、排泄1.分别以反义探针小剂量、中剂量、大剂量浓度给药后,药物动力学分布均符合二室模型。2.小剂量给药后半衰期138.96min,药时曲线下面积7029.03ug·ml-1·min-1,清除速率0.000427mg·kg-1·min-1,血浆蛋白结合率23.6%。3.中剂量给药后半衰期142.05min,药时曲线下面积13502.21ug·ml-1·min-1,清除速率0.000444mg·kg-1·min-1,血浆蛋白结合率24.1%。4.大剂量给药后半衰期210.66min,药时曲线下面积28311.73ug·ml-1·min-1,清除速率0.000444mg·kg-1·min-1,血浆蛋白结合率24.3%。5.原子吸收光谱法显示反义探针静脉注射后主要分布在肝、脾组织中,180min达到高峰,之后缓慢下降;MR扫描后通过测定前述脏器的信噪比,得出同样的结论。6.反义探针在小鼠体内经过肠道排出量高于肾脏排出量。第四部分反义探针体外转染高表达c-erbB2癌基因的SK-Br3肿瘤细胞株1.MTT法及台盼蓝排除实验显示反义探针转染后对SK-Br3肿瘤细胞株的增殖活力无明显影响。2.通过RT-PCR法检测c-erbB2基因mRNA及Western blot法检测细胞c-erbB2蛋白表达,发现反义探针对SK-Br3细胞的mRNA与蛋白表达均存在抑制作用。3.对转染细胞的形态学（光学及电子显微镜）观察,显示SK-Br3细胞内存在较多铁颗粒,而对照组几乎没有。4. SK-Br3细胞内铁含量与与对照组比较,差异有显著性（F=198.79,P=0.00073）,并明显高于各对照组。5.MR扫描显示转染后的SK-Br3细胞信号明显降低;与对照组比较,信噪比的差异有显著性（P<0.01）。第五部分SPIO标记的c-erbB2癌基因反义探针用于活体磁共振基因成像1.成功构建荷瘤裸鼠模型,两种荷瘤模型在外观上无差别。2.T1WI SE序列对注射反义探针后各时间点的信号强度变化不敏感,信噪比没有统计学上的差别;而其余三个扫描序列（T2WI FSE序列、T2* WI SE序列及T2* FSPGR序列）对注射反义探针后各时间点的信号强度均显示不同程度降低,信噪比有差异。3. SK-Br3细胞荷瘤裸鼠肿瘤组织在注射反义探针后10min扫描显示信噪比值下降,但肉眼无法确定,30min肉眼可见信号轻度降低,60min信号降低明显,180min降至最低,之后逐渐升高;Fuda细胞荷瘤裸鼠肿瘤组织注射反义探针后10min扫描显示信噪比值有下降,但肉眼无法确定,之后信噪比值下降不明显,无统计学上差异。4.病理学检查显示SK-Br3肿瘤组织内散在大量斑点状蓝色铁颗粒,而Fuda肿瘤组织内没有。结论:本研究中首先制备用于寡核苷酸载体的SPIO,它具有粒径小,分散度好,磁学参数理想等特点,对小鼠无明显急性毒性,稳定性好,具备作为MR成像对比剂的特点。之后采用化学交联法,连接SPIO与ASODN制成反义探针,该探针具有联接率高、粒径小等特点,超顺磁性,无明显急性毒性,4℃±1℃条件下放置3月后保持原有的稳定性。半衰期长,血浆蛋白结合率适中,使用该探针转染SK-Br3肿瘤细胞株,对细胞活力变化无明显影响,具有较强的特异性,能有效进入细胞内,并明显降低MR扫描下的信号强度。使用该探针用于活体荷瘤裸鼠MR成像,在不同扫描序列及不同时间点观察,发现该反义探针具有较好的靶向性,最佳的扫描时间在注射探针后的60min～180min。本研究SPIO标记的c-erbB2癌基因反义寡脱氧核苷酸探针研制并用于磁共振基因成像,在探索肿瘤的早期、特异性诊断方面,迈出了可喜的一步。