嗜酸氧化亚铁硫杆菌比较蛋白质组学研究

论文摘要

嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans,简称A.f）是生物浸矿应用最广泛的菌种之一,它能氧化亚铁、硫和还原态的硫化物。A.f菌是浸矿细菌研究的模式菌,对其亚铁氧化机制已经有大量研究,并发现了部分电子传递载体,如:亚铁氧化酶、铜蓝蛋白、细胞色素C氧化酶、细胞色素C、bcl色素复合体等。并提出了多条亚铁氧化电子传递途径,但是这些电子传递途径都没有得到充分的证明,存在很多争议。硫氧化机制的研究进展比较缓慢,研究认为硫的氧化与Fe2+的氧化还原存在偶联,Fe3+可以作为电子受体使硫发生氧化,单质硫或还原态硫化物被氧化为亚硫酸后再进一步氧化为硫酸。在以单质硫为唯一能源,没有铁离子存在条件下,单质硫能被氧化利用。证明在嗜酸氧化亚铁硫杆菌中存在另一条单质硫氧化途径,这一途径不需要铁离子的参与。在A.f菌中存在多种可能与硫氧化和转运相关蛋白,但这些蛋白在细胞内的功能,及其参与的反应现在并不清楚。在浸矿过程中,随着pH的降低,矿物中的离子会不断溶解到A.f菌生长的环境中,高浓度离子会抑制细菌的浸矿能力。目前该菌对高离子浓度抗性机制已有很多报道,有人认为对高浓度离子抗性的可能机制有一下几点。1、在高离子浓度环境的选择压力下有利突变的不断积累导致抗性增强,但目前并没有具体实验证明。2、有人认为这种抗性产生原因是A.f菌内IS序列在基因组内插入突变导致该菌对高离子浓度抗性增强。3、另一种推测认为该菌对不同离子抗性与细菌内的质粒有关,虽然该细菌中存在多种质粒,但这些质粒与离子抗性的关系还没有得到证实。因此A.f菌亚铁和硫氧化机制及高离子浓度抗性机制研究仍然是一个急待解决的问题,不仅对A.f菌在生物冶矿方面的应用具有重要指导意义,而且对其它浸矿菌的研究也具有重要意义。本论文主要工作有以下两点:1.A.f菌以硫或亚铁为唯一能量来源培养条件下比较蛋白质组学研究通过双向电泳技术和MALDI—TOF MS技术对亚铁为唯一能量来源和硫为唯一能量来源培养的A.f菌进行比较蛋白质组学分析,成功鉴定了24个差异蛋白点,其中16个蛋白点在硫氧化过程中上调,8个点下调,然后通过Northern blot验证这些差异蛋白在RNA水平差异。差异蛋白包括二硫键还原酶:硫氧还蛋白二硫键还原酶、嘧啶核苷二硫键还原酶、异二硫键还原酶。分子伴侣蛋白:热激蛋白Hsp20。硫代谢相关蛋白:亚硫酸还原酶、半胱氨酸脱硫酶。抗氧化蛋白:AhpC-TSA family-glutaredoxin domain protein、antioxidant,AhpC-Tsafamily。环四吡咯环合成重要酶:谷氨酰-tRNA还原酶。糖代谢相关蛋白:二磷酸果糖醛缩酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、转二羟丙酮基酶。多种未知功能蛋白,多种假定蛋白。从实验结果可以看出细胞内多条代谢途径与铁、硫氧化及铁、硫氧化环境适应性相关。2.A.f菌在正常条件下和高离子浓度条件下比较蛋白质组学研究通过双向电泳技术和MALDI—TOF—TOF串联质谱技术对正常条件下亚铁氧化培养和加有0.1M KCl亚铁氧化培养的A.f菌进行比较蛋白质组学分析,成功鉴定了8个差异蛋白点,4个蛋白点在高KCl离子浓度条件上调,4个点下调。然后通录水平过Northern blot验证这些差异蛋白在RNA转差异,发现有7个蛋白在RNA水平有差异。4号蛋白点（methionine aminopeptidase,typeⅠ）在RNA水平差异不明显。这些差异蛋白主要涉及糖代谢基因:GDP-D-甘露糖脱水酶、5-磷酸核糖异构酶:核苷酸合成酶:磷酸核糖焦磷酸激酶:ATP合成酶δ与β亚基;甲硫氨酰氨肽酶;磷酸乙醇酸磷酸酶;一个假定蛋白。其中GDP-D-甘露糖脱水酶、5-磷酸核糖异构酶两种酶所参与的糖代谢途径可能与多糖的合成有关,推测A.f菌对高离子浓度抗性可能与多糖的合成有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 生物浸矿应用概况
• 1.2 嗜酸氧化亚铁硫杆菌（A.f）研究进展
• 1.2.1 嗜酸氧化亚铁硫杆菌（A.f）亚铁和硫氧化机制
• 1.2.2 嗜酸氧化亚铁硫杆菌（A.f）离子抗性机制
• 1.3 蛋白质组学简介
• 1.3.1 蛋白质组学的研究内容
• 1.3.2 蛋白质分离技术——双向电泳技术
• 1.3.3 蛋白质鉴定技术——质谱技术
• 1.3.3 蛋白质组学相关生物信息学的发展
• 1.4 本论文研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 试剂盒
• 2.1.4 工具酶
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.1.7 培养基
• 2.1.8 引物合成
• 2.1.9 常用试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 嗜酸氧化亚铁硫杆菌的培养
• 2.2.2 双向电泳样品制备
• 2.2.3 双向电泳
• 2.2.4 MALDI-TOF分析
• 2.2.5 探针制备
• 2.2.6 Northern杂交
• 3 结果与讨论
• 3.1 氧化亚铁硫杆菌在亚铁或硫为唯一能量来源培养条件下比较蛋白质组学分析
• 3.1.1 双向图谱分析
• 3.1.2 MALDI—TOF MS分析
• 3.1.3 Northern杂交
• 3.1.4 讨论
• 3.1.5 小结
• 3.2 嗜酸氧化亚铁硫杆菌在高浓度KCl离子培养条件下和正常培养条件下比较蛋白质组学分析
• 3.2.1 双向图谱分析
• 3.2.2 MALDI—TOF—TOF串联质谱分析
• 3.2.3 Northern杂交
• 3.2.4 讨论
• 3.2.5 小结
• 参考文献
• 缩写词简表
• 附录
• 致谢