水稻功能候选基因RNA干涉载体的构建及其应用

论文摘要

RNA干涉（RNA interference，RNAi）技术是通过双链RNA的介导特异性地降解相应序列的mRNA，从而导致转录后水平的基因沉默。该技术已被广泛应用于植物基因功能研究。与其他技术相比，RNA干涉技术具有特异性强、沉默效率高等优点。本文应用Gateway技术进行水稻功能候选基因RNA干涉表达载体的构建，并进行遗传转化研究。Gateway技术是通过多重载体，高效构建目标基因及任何DNA片段克隆载体和表达载体。该技术以λ噬菌体的位点特异性重组体系为基础，两端具有位点的DNA片段或目标基因可以非常容易地被重组克隆到含同源重组位点的载体上。本文采用Gateway技术体系，以水稻细胞程序性死亡相关功能候选基因OsCDC5、OsDAD1、OsPDCD5为目的基因，从中选取目标区段进行RNA干涉表达载体的构建，经过attB-PCR扩增、BP反应、LR反应后，成功构建了三个水稻功能候选基因的RNA干涉双元表达载体，为大规模构建水稻功能候选基因RNAi载体打下了基础。构建完成的载体通过农杆菌介导法转化籼稻IR64，经过共培养、筛选培养、预分化培养、分化培养等获得122株转基因植株。同时在转基因过程中对籼稻IR64愈伤组织诱导、分化以及农杆菌转化水稻的各个参数进行优化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物功能候选基因的分析策略
• 1.1.1 寻找功能候选基因
• 1.1.2 功能候选基因的验证
• 1.2 植物细胞程序化死亡相关功能候选基因
• 1.2.1 植物PCD研究概况
• 1.2.2 植物PCD的基本特征
• 1.2.3 植物PCD相关基因
• 1.2.4 水稻PCD相关基因
• 1.3 RNA干涉技术及其在基因功能研究中的应用
• 1.3.1 RNA干涉现象的发现过程
• 1.3.2 RNA干涉的分子机制
• 1.3.3 RNA干涉的特点
• 1.3.4 植物RNA干涉载体特征
• 1.3.5 应用Gateway技术构建RNA干涉载体
• 1.4 目的和意义
• 第二章 构建水稻功能候选基因的RNA干涉载体
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 水稻材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 RNA干涉区段选择及引物设计
• 2.1.4 TRIzol法提取籼稻IR64总RNA
• 2.1.5 RT-PCR
• 2.1.6 attB-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.7 纯化回收attB-PCR产物
• 2.1.8 BP反应
• 2.1.9 LR反应
• 2.1.10 表达克隆转化农杆菌LBA4404感受态细胞
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 RNA干涉区段选择与PCR引物设计
• 2.2.2 水稻总RNA检测
• 2.2.3 attB-RCR产物琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.4 BP反应阳性克隆检测
• 2.2.5 表达克隆转化农杆菌LBA4404
• 第三章 RNA干涉载体对籼稻IR64的遗传转化
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料和试剂
• 3.1.2 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 3.1.3 转化条件的优化
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 出愈率以及愈伤生长状态的研究
• 3.2.2 提高愈伤组织分化频率的研究
• 3.2.3 潮霉素筛选浓度的确定
• 第四章 讨论
• 4.1 RNA干涉载体的构建方法
• 4.2 影响RNA干涉效率的因素
• 4.3 应用Gateway技术构建RNA干涉载体注意事项
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ RNA干涉载体示意图
• 附录Ⅱ 水稻转化组织培养图片
• 致谢
• 作者简历