表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建及动物免疫试验

论文摘要

本研究目的旨在构建一种表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗,通过动物免疫试验对构建的疫苗进行评价。Cap蛋白是PCV2 ORF2基因编码的主要结构蛋白和免疫保护性蛋白,本研究选择截去N端41个氨基酸的核定位区的ORF2编码基因作为目的基因,利用减毒鼠伤寒沙门氏菌的平衡致死系统表达优化的ORF2基因,构建表达Cap蛋白的活载体疫苗,并对重组菌苗的生物学特性和免疫学特性进行评价。研究取得如下结果:1表达猪圆环病毒Cap蛋白的鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建合成特异性引物P1、P2,PCR扩增得到ORF2基因,将其插入经BamH I和Pst I双酶切的Asd+的组成型表达载体pYA3341中,构建重组表达载体pYA3341-ORF2;重组载体电转化入缺失天冬氨酸-β-半醛脱氢酶（Δasd）、腺苷酸环化酶（Δcya）以及环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）的减毒鼠伤寒沙门氏菌中间宿主菌X3730及终末宿主菌X4550中,获得重组活载体疫苗菌X4550（pYA3341-ORF2）。2重组活载体疫苗菌的生物学特性检测研究重组活载体疫菌苗X4550（pYA3341-ORF2）体外稳定特性、生长特性、口服安全性及在小鼠体内的定值分布情况。结果显示,Cap蛋白能在X4550中有高水平的表达,且重组菌能在体外稳定遗传、生长状态良好、口服安全无毒性及在机体中具有良好的定值分布特性。3重组活载体疫苗菌的免疫原性研究将重组活载体疫苗菌X4550（pYA3341-ORF2）口服免疫Balb/C小鼠作为免疫组,以口服重组菌X4550（pYA3341）的小鼠作为阴性对照组,以口服PBS的小鼠作为空白对照组。ELISA方法检测疫苗免疫组小鼠血清抗体效价达到1:1920;间接免疫荧光法检测疫苗免疫组小鼠血清中和抗体效价可达到1:19.2;MTT法检测免疫组小鼠淋巴细胞分裂指数可达到4.26;流式细胞术检测疫苗免疫组小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞数目分别约为29.9、7.52,CD4+/CD8+T细胞比值约为3.99。将重组活载体疫苗菌X4550（pYA3341-ORF2）免疫猪,ELISA法检测疫苗免疫猪血清抗体效价1:57.6;疫苗免疫组猪血清的中和抗体效价可达到1:11.2;疫苗免疫组淋巴细胞分裂指数可达到3.82。重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）能够稳定表达Cap蛋白,具有良好免疫原性,为该疫苗的进一步研制与临床应用提供参考依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 猪圆环病毒Ⅱ型的研究概况
• 1.1 猪圆环病毒的病原学与流行病学特征
• 1.2 猪圆环病毒Ⅱ 型的分子生物学特征
• 1.2.1 基因序列特征
• 1.2.2 PCV2 的主要结构蛋白
• 1.3 猪Ⅱ 型圆环病毒的致病机制
• 1.3.1 致病机制
• 1.3.2 PCV2 的嗜组织特性
• 1.3.3 PCV2 侵袭宿主细胞引起其增殖的特性
• 1.3.4 免疫抑制
• 1.3.5 诱发因素
• 1.4 PCV2 综合防治措施
• 1.4.1 做好引种检疫
• 1.4.2 强化饲养管理，减少应激
• 1.4.3 定期消毒
• 1.4.4 免疫预防
• 1.4.5 药物预防
• 1.5 PMWS 的诊断
• 1.5.1 临床诊断
• 1.5.2 PCV2 感染的病理学诊断
• 1.5.3 病原学诊断
• 1.6 疫苗的研究进展
• 1.6.l 灭活疫苗
• 1.6.2 弱毒活疫苗
• 1.6.3 基因工程疫苗
• 试验研究
• 第二章 表达PCV2 CAP 蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒（菌）株、质粒
• 2.1.2 工具酶及主要试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 溶液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 PCR 引物合成
• 2.2.2 PCV2 ORF2 基因的扩增
• 2.2.3 PCR 产物电泳检测及回收
• 2.2.4 克隆载体的构建
• 2.2.5 重组表达质粒 pYA3341-ORF2 的构建
• 2.2.6 pYA3341-ORF2 重组质粒依次转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730 和X4550
• 2.2.7 重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）表达蛋白的鉴定
• 2.2.8 重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）体外特性检测
• 2.3 结果及分析
• 2.3.1 PCR 扩增目的基因
• 2.3.2 重组克隆质粒pGEM-T-ORF2 的构建和鉴定
• 2.3.3 重组表达质粒pYA3341-ORF2 的构建和鉴定
• 2.3.4 Cap 蛋白的表达及Western blot 分析
• 2.3.5 重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）的体外稳定性
• 2.3.6 重组菌苗X4550（pYA3341-ORF2）生长状况分析
• 2.3.7 重组菌苗的安全性试验
• 2.3.8 重组菌苗口服免疫后在小鼠体内的分布和表达
• 2.4 讨论
• 2.4.1 目的基因的选择
• 2.4.2 选择减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体制备口服疫苗的原因
• 2.4.3 沙门氏菌的免疫机制
• 2.4.4 表达系统的选择—非抗性的载体-宿主平衡致死系统
• 2.4.5 重组疫苗株的稳定性和安全性
• 2.4.6 目的蛋白的表达
• 2.4.7 关于重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗菌株的转化及鉴定
• 2.5 小结
• 第三章 重组菌苗X4550（PYA3341-ORF2）的动物免疫试验
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 试验器材
• 3.1.3 试验动物
• 3.1.4 菌种和质粒
• 3.1.5 溶液的配制
• 3.2 小鼠免疫试验
• 3.2.1 重组菌X4550（pYA3341-ORF2）和X4550（pYA3341）的大量制备
• 3.2.2 试验小鼠分组
• 3.2.3 试验小鼠免疫
• 3.2.4 免疫小鼠血清的收集
• 3.2.5 免疫小鼠血清抗体效价测定
• 3.2.6 免疫小鼠抗体中和活性测定
• 3.2.7 MTT 检测重组菌苗免疫小鼠脾的T 淋巴细胞增殖
• 3.2.8 免疫小鼠脾脏T 淋巴细胞亚群的测定
• 3.3 猪免疫试验
• 3.3.1 重组菌X4550（pYA3341-ORF2）和X4550（pYA3341）的大量制备
• 3.3.2 试验猪分组
• 3.3.3 试验猪免疫
• 3.3.4 免疫猪血清的收集
• 3.3.5 免疫猪血清抗体的检测
• 3.4.6 免疫猪血清抗体中和活性检测
• 3.3.7 免疫猪外周血淋巴细胞增殖试验
• 3.4 结果及分析
• 3.4.1 免疫小鼠血清抗体效价检测结果
• 3.4.2 免疫小鼠血清抗体中和活性检测结果
• 3.4.3 免疫小鼠淋巴细胞增殖试验结果
• 3.4.4 免疫小鼠脾脏T 淋巴细胞亚群的测定结果
• 3.4.5 免疫猪血清抗体的检测
• 3.4.6 免疫猪血清抗体中和活性检测结果
• 3.4.7 免疫猪淋巴细胞转化试验结果
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词及中英文对照
• 致谢
• 作者简介