论文摘要
靶向治疗是目前肿瘤治疗的趋势,将具有一定功能的基因或药物靶向性地导入肿瘤细胞,可有效修复肿瘤基因突变、改变肿瘤生长环境、诱发机体免疫反应,直接或间接杀灭肿瘤细胞。靶向治疗的重要环节是将目的基因或药物运送至特定部位的载体,尤其在基因治疗过程中,将目的基因导入靶细胞的转基因载体是基因治疗能否成功的关键,也是目前基因治疗的瓶颈。应用于基因治疗的的载体主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体转染效率高,是目前体内基因治疗的主要工具,但存在潜在感染、免疫原性等缺点,在体内不能重复使用,并且携带目的基因的大小受到限制。非病毒载体具有安全性高、无免疫原性、制备简单、易于对DNA进行操作等特点,已经越来越受到人们的重视。但非病毒载体转染效率仍不如病毒载体,而且往往通过内吞方式无选择性地进入细胞,因此,解决其转染效率及靶向性问题是当前非病毒载体研究最为关注的领域。研究肿瘤细胞特异性表达受体,通过受体介导方式导向肿瘤细胞的非病毒载体是最常用和有效的策略。同时需要关注的是非病毒载体的毒性,许多研究发现,随着浓度和分子量的增加,非病毒载体的转染效率增加,但对细胞的毒性也随之增加。因此,构建安全、有效、靶向性高的非病毒载体是目前靶向治疗的热门话题,而通过一系列理化方法将各种阳离子聚合物等非病毒载体进行修饰改造,降低毒性、增加转染效率和靶向性是一个可行的策略。聚丙基乙烯亚胺树枝状聚合物（Polypropylenime dendrimers,DABs）是一类阳离子聚合物,表面携带—NH2,富含阳离子,能有效结合DNA,并通过内吞方式进入细胞进行表达。DABs（DAB-4,DAB-8,DAB-16）结构简单,细胞毒性低,适用于各种方式的修饰。环糊精（cyclodextrin,CyD）是一类具有不同尺寸的环状化合物,能够选择性地键合各种有机、无机合生物分子形成配合物,且能有效结合并打开细胞膜,增加转基因载体的转染效率。叶酸受体是肿瘤特异性表达的受体,在许多上皮来源的肿瘤中呈高表达,已有研究发现,非病毒载体以叶酸标记后,在多种细胞系能够以受体介导内吞方式增加转染效率。本研究以CyD为骨架,结合低分子量DABs,目的在于不增加细胞毒性的前提下提高载体的转染效率,并进一步耦合肿瘤特异性配体——叶酸,在胃、肠、肝脏恶性肿瘤细胞中验证配体化合物CyD-DAB-FA的细胞毒性及转染效率,从中筛选出消化系统肿瘤靶向性的非病毒载体,进一步应用于肿瘤的体内及临床治疗。研究分为三部份:第一部分:CyD-DABs载体化合物的合成与化学表征,检测载体化合物的性质和对DNA的包裹、浓聚能力;第二部分:CyD-DABs载体化合物的生物学表征,通过体外细胞毒性检测及转染实验,从中筛选出高转染效率、低毒性的载体化合物,应用于下一步实验;第三部分:将第二部分筛选出的CyD-DABs载体化合物耦合配体叶酸,构建CyD-DAB-FA配体化合物,进行化学表征,并通过体外细胞毒性与转染实验检测配体化合物的细胞毒性与转染效率,评价其在体内应用的价值。第一部分:CyD-DABs载体化合物的合成与化学表征目的:以CyD为骨架,结合DABs,优化合成条件,通过化学方法表征产物的性质,并通过凝胶电泳分析与电镜观察、粒径、表面电荷测定等方法,检测载体化合物对DNA的包裹、浓聚能力。方法:以CDI为连接媒介,合成CyD-DABs,通过核磁共振（1H NMR）、元素分析、傅立叶红外光谱（FT-IR）、热重量分析（TGA）等方法测定化合物的理化性质。将CyD-DABs与DNA结合后,通过凝胶电泳分析确定化合物对DNA的包裹与浓聚能力,扫描电镜观察确定结合后的微粒大小,并测定其粒径与表面携带电荷里。结果:共合成18种CyD-DABs载体化合物。1H NMR、FT-IR、TGA检测结果显示CyD-DABs为耦联产物,形成新的基团,但仍保留CyD与DAB各自的属性。1H NMR显示CyD-DABs中CyD及DAB的各自接入量,并通过元素分析进一步验证两者接入比例。CyD-DABs与DNA结合后,能中和DNA表面负电荷并阻滞DNA在电荷作用下移动,扫描电镜下观察到结合后的CyD-DAB/DNA复合物粒径在150～200nm之间,与粒径测定结果吻合,表面电荷测定提示CyD-DAB/DNA复合物表面携带正电荷,最大值25mV左右。结论:CyD-DABs载体化合物能有效结合DNA,结合后的复合物直径在150～200nm之间,表面带正电荷,能与细胞膜结合并被内吞。第二部分:CyD-DABs载体化合物的生物学表征目的:通过体外细胞学实验检测载体化合物CyD-DABs的细胞毒性与基因转染能力,优化转染条件,并从中筛选毒性低、转染效率高的化合物,用于下一步实验。方法:将CyD-DABs按不同浓度作用于COS7、HepG2、SGC7901、RKO细胞,24小时后,MTT法检测细胞存活率,计算载体化合物的细胞毒性。并将CyD-DABs与荧光素酶表达质粒pCAG-Luc结合后,分别应用于COS7、HepG2、SGC7901、RKO、SMMC7721细胞,转染后继续表达24～48小时,通过荧光素酶表达水平检测及荧光显微镜观察,测定其转染效率,并从中筛选出毒性低、转染效果佳的化合物。同时,模拟体内环境进行有血清条件下转染,检测化合物在血清中的转染性能。结果:CyD-DABs载体化合物在各类细胞中均具有良好的安全性,在转染浓度范围内,细胞存活率均＞90%,但CyD-DAB-16细胞毒性相对较大,浓度增加至25μg/ml时仅有一半细胞存活,在转染实验中发现细胞死亡较多,影响转染效率。CyD-DAB-4及CyD-DAB-8毒性小,适合进一步转染。其中α-CyD-DAB-8、β－CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8在转染过程中显示良好的转基因性能,在无血清转染条件下,已接近或超过阳性对照PEI 25KD的转染水平,而在有血清转染条件下,转染效率有所降低,但仍显著超过阳性对照组。结论:α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8细胞毒性小,转染效率高。在有血清条件下,转染效率较阳性对照组高,表明载体化合物更适用于体内研究,因此选择这三种载体化合物进行下一步实验。第三部分:叶酸配体耦合的CyD-DAB-FA配体化合物的化学与生物学表征目的:α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8耦合肿瘤特异性配体——叶酸（folate,FA）,进行化学表征与生物学表征,评价耦合叶酸的配体化合物的毒性、转染能力与靶向性。体外细胞学实验进一步评价毒性与转染性能。方法:叶酸经CDI活化后,分别与α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8混合反应,形成配体化合物α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA、γ-CyD-DAB-8-FA。通过1H NMR、FT-IR表征化合物的理化性质。在叶酸受体阳性（FR+）的KB细胞系中,通过MTT试验检测配体化合物的细胞毒性。将耦合配体的载体化合物与pCMV-luc质粒结合后,作用于KB细胞,继续增殖表达48小时,测定荧光素酶活性,并分别以α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8与FA的混合物及PEI 25KD为阴性和阳性对照。模拟体内环境进行有血清条件下转染,检测配体化合物在血清中的转染效率。结果:配体化合物α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA、γ-CyD-DAB-8-FA在低浓度时有一定的促细胞增殖作用,而随浓度增加,细胞毒性无明显增加,在100μg/ml时细胞存活率仍为90%。在KB细胞中进行配体化合物的转染实验,结果提示无血清转染条件下,β-CyD-DAB-8-FA的转染效率超过阳性对照PEI25KD,而α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA、γ-CyD-DAB-8-FA的转染效率较单纯将α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8与FA混合明显增高。在有血清转染条件下,新化合物转染性能较单纯混合物增加更明显,其中α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA的转染效率显著超过阳性对照PEI 25KD。结论:耦合配体FA后的配体化合物,其转染效率较未接入配体时明显增加,并且在血清中显示良好的转染性能,其中α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA转染效率高,可进一步用于体内FR表达阳性的肿瘤治疗。主要结论1、本研究合成了一系列CyD-DABs化合物,优化了合成条件,通过化学方法表征了化合物的理化性质。2、体外细胞学实验中优化CyD-DAB载体化合物的转染条件,并模拟体内环境进行转染,发现CyD-DAB-8有良好的转基因能力,从中筛选出低毒性、高转染效率的化合物α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8。3、本研究成功将CyD-DABs载体化合物与叶酸以化学方法耦联,最终获得可溶性配体化合物α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA、γ-CyD-DAB-8-FA。4、进一步通过体外细胞转染,发现α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA、γ-CyD-DAB-8-FA在FA受体（FR）表达阳性的细胞中有较高的转染效率,并且在有血清条件下其转染性能不受影响。其中α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA在血清中转染效率显著高于传统非病毒载体PEI 25KD及α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8。5、载体化合物CyD-DAB的细胞毒性有以下趋势:γ-CyD-DAB-16＞β-CyD-DAB-16＞α-CyD-DAB-16＞γ-CyD-DAB-8＞β-CyD-DAB-8≥α-CyD-DAB-8≥γ-CyD-DAB-4≥β-CyD-DAB-4≥α-CyD-DAB-4。化合物与叶酸连接后,其细胞毒性减低,并在低浓度时有轻度促细胞生长作用,表明叶酸配体化合物具有叶酸的促增殖特性,同时研究发现叶酸能中和阳离子聚合物的细胞毒性。6、耦合配体叶酸的载体化合物具有叶酸受体靶向性,在血清中能达到较高水平的转染,对于叶酸受体阳性的消化系统肿瘤,新化合物有望进一步应用于体内实验及临床试验。