蛙虹彩病毒（RGV）的复制与宿主细胞骨架及超微组织变化

论文摘要

RGV（Rana grylio virus）是从我国患病的美国青蛙中分离到的一种蛙虹彩病毒。超微观察表明,RGV装配是在胞质内的病毒装配区（viromatrix）中进行的。我们利用电镜技术、免疫学技术、流式细胞技术及分子生物学等技术方法,对RGV的复制与宿主细胞骨架及超微组织变化等进行了研究。主要结果如下:1.在RGV感染的不同时间,通过电镜观察对鲤鱼上皮瘤（epithelipma papulosum cyprini,EPC）细胞内病毒装配区进行了定性和定量的分析。在感染6 h的细胞内,近核区域观察到病毒装配区。该区域的电子密度比周围胞质相比较浅,不含有细胞器（如线粒体、细胞骨架等）。在装配区内,观察到不同形态的病毒装配中间体和一些无定形结构:管状物和膜样物质。管状物直径约110-124nm,它的一端和病毒空心衣壳相连。膜样物质由三层膜组成,它的一端和病毒装配中间体相连。此外,在装配区内,还观察到一些致密絮状物质和直径约40-50nm小管等。共观察了990个细胞用于病毒装配区的定量分析。结果表明,394个细胞中含有装配区,其中89.3%含有一个,10.7%含有两个以上。装配区的数目从感染6 h逐步增加直至16 h达到最大值。装配区的面积在感染24 h时增加到7.4±0.69μm2,约是感染6 h时的三倍。病毒装配区内空心衣壳的数目总大于完整的病毒粒子数目,并且两者之间有明显的正相关。2.为进一步确定无定形结构与病毒装配的关系,利用免疫电镜技术,对RGV感染的EPC细胞进行了观察。比较不同固定液、脱水条件、包埋剂、抗体浓度及染色液对样品观察的效果,选择优化组合。用4%多聚甲醛-0.25%戊二醛混合固定液固定感染细胞,酒精完全脱水,LR White包埋样品制备超薄切片;再以提纯RGV为抗原制备的兔抗血清（1:40）为一抗,直径10nm羊抗兔IgG-胶体金（1:50）为二抗,免疫染色后进行超微观察。结果表明,病毒装配阶段,胶体金颗粒主要结合于病毒粒子的衣壳上;而在病毒成熟释放阶段,通过出芽进入到胞质小泡或释放到胞外的病毒粒子囊膜上有胶体金信号。除了病毒粒子外,与病毒装配相关的结构上也都有胶体金强信号,如病毒装配区内的致密团块絮状物质上、膜样结构和管状物的外层膜上。但在正常胞器上没有观察到明显的标记。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 第一节 电子显微镜技术在病毒学中的应用
• 1.1.1 透射电镜技术
• 1.1.1.1 超薄切片技术
• 1.1.1.2 负染色技术
• 1.1.1.3 免疫电镜技术
• 1.1.1.4 电镜计数
• 1.1.2 扫描电镜技术
• 第二节 哺乳动物病毒的装配及病毒与宿主细胞的相互作用
• 1.2.1 病毒的装配
• 1.2.2 病毒感染对宿主大分子合成及功能的影响
• 1.2.2.1 病毒对宿主蛋白合成的抑制
• 1.2.2.2 病毒对宿主转录干扰
• 1.2.2.3 病毒对宿主DNA 合成的影响
• 1.2.3 病毒感染对细胞成分的影响
• 1.2.3.1 病毒感染与细胞膜
• 1.2.3.2 病毒感染与细胞骨架
• 1.2.3.3 病毒感染与线粒体
• 1.2.4 病毒感染与细胞凋亡
• 第三节 水生动物虹彩病毒复制和病毒与宿主细胞的相互作用
• 1.3.1 虹彩病毒生物学特性和分类
• 1.3.2 蛙虹彩病毒的复制
• 1.3.2.1 病毒的吸附和进入
• 1.3.2.2 病毒的复制、转录和翻译
• 1.3.2.3 病毒的装配与释放
• 1.3.3 虹彩病毒与宿主细胞的相互作用
• 1.3.3.1 病毒感染与宿主细胞大分子合成
• 1.3.3.2 病毒感染与细胞骨架
• 1.3.3.3 病毒感染与线粒体
• 1.3.3.4 病毒感染与细胞调亡
• 第四节 本研究的背景及目的意义
• 第二章 RGV 装配区的定性和定量分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 细胞和病毒
• 2.2.2 感染细胞超薄切片制样
• 2.2.3 病毒感染时序及装配区的定量分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 RGV 感染时序的定量分析
• 2.3.2 RGV 装配区的超微结构观察
• 2.3.3 装配区的定量分析
• 2.3.4 病毒装配中间体多样性观察
• 2.4 讨论
• 第三章 RGV 感染鱼类细胞免疫电镜方法的建立及其应用
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 病毒扩增和提纯
• 3.2.2 负染制样
• 3.2.3 RGV 抗体制备
• 3.2.4 RGV 抗体效价检测
• 3.2.4.1 琼脂凝胶免疫扩散法
• 3.2.4.2 酶联免疫吸附测定法（ELISA）
• 3.2.5 免疫电镜制样
• 3.2.5.1 样品制备
• 3.2.5.2 切片的免疫染色
• 3.2.5.3 定量分析免疫标记强度
• 3.2.6 免疫荧光显微镜样品的制备
• 3.3 结果
• 3.3.1 提纯病毒的电镜负染观察
• 3.3.2 抗体效价的测定
• 3.3.3 免疫电镜不同制样方法对样品观察的影响
• 3.3.3.1 样品超微结构观察
• 3.3.3.2 样品免疫染色观察
• 3.3.4 感染细胞的免疫染色观察
• 3.3.4.1 RGV 装配阶段的免疫电镜观察
• 3.3.4.2 RGV 成熟阶段的免疫电镜观察
• 3.3.5 两种鱼类细胞中RGV 的装配
• 3.4 讨论
• 第四章 宿主细胞微管的形态变化及对 RGV 释放过程的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 病毒、细胞、试剂和抗体
• 4.2.2 细胞活力测定
• 4.2.2.1 台盼兰排除法
• 4.2.3 荧光显微镜样品制备
• 4.2.4 超薄切片制样和定量分析
• 4.2.5 病毒产量的测定
• 4.2.5.1 空斑法
• 4.3 结果
• 4.3.1 秋水仙素对细胞活力影响
• 4.3.2 微管形态的变化
• 4.3.3 秋水仙素处理后微管形态和病毒装配
• 4.3.4 秋水仙素处理对病毒产量的影响
• 4.4 讨论
• 第五章 宿主细胞中等纤维及微丝对 RGV 感染的影响
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 病毒、细胞和试剂
• 5.2.2 细胞活力测定
• 5.2.3 超薄切片制样和定量分析
• 5.2.4 病毒产量的测定
• 5.3 结果
• 5.3.1 试剂对细胞活力的影响
• 5.3.2 EPC 细胞内RGV 装配区超微结构观察
• 5.3.3 RGV 释放的电镜观察
• 5.3.4 丙烯酰胺和EGTA 分别对病毒产量的影响
• 5.4 讨论
• 第六章 RGV 感染与线粒体的关系
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 病毒、细胞和试剂
• 6.2.2 质粒提取和细胞转染
• 6.2.2.1 pDsRed2-Mito 质粒的提取
• 6.2.2.2 pDsRed2-Mito 在FHM 细胞系中的稳定转染
• 6.2.3 细胞培养与病毒感染
• 6.2.4 荧光显微镜样品的制备
• 6.2.5 电镜样品制备和定量分析
• 6.2.6 线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, Δψm）检测
• 6.2.7 线粒体呼吸（mitochondrial respiration, MR）检测
• 6.2.8 Caspase-3 活性测定
• 6.3 结果
• 6.3.1 线粒体超微结构观察的
• 6.3.2 细胞内线粒体的分布
• 6.3.3 线粒体Δψm 和线粒体呼吸的变化
• 6.3.4 Caspase-3 活性检测
• 6.4 讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录攻读博士学位期间发表论文目录
• 致谢