水稻蛋白激酶的克隆及体外表达

论文摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物之一,也是基础研究的模式植物之一。水稻中有上千个蛋白激酶,它们几乎与所有的发育过程有关,也包括抗病、抗虫等逆境反应,克隆与表达这些基因是了解其功能的首要步骤,这对了解水稻抗逆机理,调控抗逆过程等方面具有重要意义。 本研究利用已公布的水稻蛋白激酶序列,用Sequencher软件设计引物,用PCR方法从水稻种子cDNA文库中扩增水稻蛋白激酶的编码序列,克隆于酵母表达载体pEGH上,在酵母Y258菌株中进行自重组,重组体转入大肠杆菌并经过酶切鉴定和测序确认后,再转入酵母菌宿主中诱导表达蛋白激酶,继而对纯化的蛋白质进行SDS-PAGE检测。结合生物信息学方法,对蛋白激酶核苷酸序列进行分析,并对其功能进行预测。结果如下: 1.采用改进的质粒DNA提取方法获得混合质粒作为PCR模板。 2.两次PCR法得到了5个水稻激酶的编码序列,不同激酶扩增条件不同。 3.优化诱导表达条件,5个激酶都有较高水平的表达。 4.经过BLASTX分析,PK1是水稻可能的蛋白激酶HvPKABA1,与小麦（Aegilops tauschii）的protein kinase 1有87%的相似性,与大麦（Hordeum vulgare subsp. Vulgare）的蛋白激酶HvPKABA1有85%的相似性。 5.经过BLASTX分析,PK2是水稻CKⅡα亚基,与黑麦草（Lolium perenne）的CKⅡα亚基有91%的相似性,与小麦（Triticum aestivum）的CKⅡα亚基有91%的相似性,与玉米CKⅡα亚基具有90%的相似性。 6.经过BLASTX分析,PK3是水稻可能的蛋白激酶AFC1,与拟南芥蛋白激酶AFC1/AME2有77%的相似性。 7.经过BLASTX分析,PK4为水稻可能的丝/苏氨酸蛋白激酶,与玉米盐诱导MAPK1的相似性为90%,与欧芹（Petroselinum crispum）的MAPK4有82%的相似性,与拟南芥MAPK4有82%的相似性。 8.经过BLASTX分析,PK5是水稻CDPK蛋白激酶,与拟南芥的CDPK有69%的相似性,与玉米的CDPK有67%的相似性。 本试验得到了5个水稻蛋白激酶,经过测序及序列相似性分析,证明这5个激酶就是目的蛋白激酶,它们可能在水稻种子发育过程中起着多方面的作用。本试验初步建立了小规模克隆与表达水稻蛋白激酶的技术体系,为规模化的克隆水稻蛋白激酶打下基础,也为其它功能基因的研究提供参考。

论文目录

• 1 引言
• 1.1 研究意义
• 1.2 蛋白激酶概述
• 1.3 植物蛋白激酶的研究概述
• 1.4 水稻基因组的研究进展
• 1.4.1 水稻基因组测序的研究进展
• 1.4.2 水稻蛋白激酶的研究现状
• 1.5 研究展望
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 生物材料
• 2.1.2 药品
• 2.1.3 仪器
• 2.2 水稻种子噬菌体CDNA文库的滴度测定
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 操作步骤
• 2.3 噬菌体库转变成细菌库
• 2.3.1 试剂
• 2.3.2 操作步骤
• 2.4 提取质粒DNA
• 2.4.1 试剂
• 2.4.2 操作步骤
• 2.5 PCR扩增水稻蛋白激酶
• 2.5.1 第一次PCR
• 2.5.2 第一次PCR产物纯化
• 2.5.3 第二次PCR
• 2.5.4 第二次PCR产物纯化
• 2.6 酵母菌转化培养
• 2.6.1 试剂
• 2.6.2 操作步骤
• 2.7 从酵母中提取质粒DNA
• 2.7.1 试剂
• 2.7.2 操作步骤
• 2.8 细菌转化筛选阳性克隆
• 2.8.1 细菌感受态制备
• 2.8.2 电击法将重组载体转入宿主细胞
• 2.8.3 提取质粒DNA并酶切鉴定
• 2.9 测序验证目的片段
• 2.10 诱导表达及SDS-PAGE检测
• 2.10.1 试剂
• 2.10.2 操作步骤
• 2.11 激酶蛋白特征及序列相似性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻种子cDNA文库滴度
• 3.2 细菌库的滴度
• 3.3 提取质粒DNA得到PCR模板
• 3.4 第一次PCR扩增
• 3.5 第二次PCR扩增
• 3.6 酵母转化、细菌转化及酶切鉴定
• 3.6.1 克隆PK1的酶切鉴定与分析
• 3.6.2 克隆PK2的酶切鉴定与分析
• 3.6.3 克隆PK3的酶切鉴定与分析
• 3.6.4 克隆PK4的酶切鉴定与分析
• 3.6.5 克隆PK5的酶切鉴定与分析
• 3.7 测序结果及分析
• 3.7.1 克隆PK1的测序结果及分析
• 3.7.2 克隆PK2的测序结果及分析
• 3.7.3 克隆PK3的测序结果及分析
• 3.7.4 克隆PK4的测序结果及分析
• 3.7.5 克隆PK5的测序结果及分析
• 3.8 激酶蛋白质表达及SDS-PAGE检测
• 3.9 激酶蛋白特征及序列相似性分析
• 3.9.1 PK1的蛋白结构及序列相似性分析
• 3.9.2 PK2的蛋白特征及序列相似性分析
• 3.9.3 PK3的蛋白特征及序列相似性分析
• 3.9.4 PK4的蛋白特征及序列相似性分析
• 3.9.5 PK5的蛋白特征及序列相似性分析
• 4 讨论
• 4.1 蛋白激酶PCR扩增
• 4.2 本研究获得的蛋白激酶的功能分析
• 4.2.1 PK1可能的功能
• 4.2.2 PK2可能的功能
• 4.2.3 PK3可能的功能
• 4.2.4 PK4可能的功能
• 4.2.5 PK5可能的功能
• 4.3 规模化克隆水稻蛋白激酶的探讨
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表论文
• 作者简历
• 致谢