红肉脐橙（Citrus sinensis [L.] Osbeck）番茄红素β-环化酶基因（Lcyb）功能的初步验证和分析

论文摘要

红肉脐橙（Citrus sinensis[L.]Osbeck）是华盛顿脐（Citrus sinensis[L.]Osbeck）的红肉突变体,是果肉呈粉红的脐橙品种,其果肉中主要含有番茄红素和β-胡萝卜素,是研究柑橘果实类胡萝卜素代谢的良好素材。番茄红素β-环化酶（LCYB）在柑橘类胡萝卜素合成代谢途径中起关键作用,该酶能使反式番茄红素转化为β-胡萝卜素,是番茄红素向下游代谢物质转化的一个关键分支点。目前,本课题组已经从红肉脐橙中克隆到番茄红素β-环化酶基因（Lcyb）,为了对该基因的功能进行鉴定分析,本研究以红肉脐橙中克隆到的番茄红素β-环化酶基因（Lcyb）两个转录本的cDNA为目的片段,通过农杆菌介导的转基因手段,以番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）为受体材料进行了遗传转化,通过抗性筛选,获得转基因植株群体,通过对转基因植株群体及其后代进行分子水平的检测和生理指标测定分析,表明红肉脐橙中克隆到的番茄红素β-环化酶基因（Lcyb）及其产物具有正常功能。主要结果如下:1.利用已构建成功的含有红肉脐橙番茄红素β-环化酶基因（Lcyb）cDNA片段的载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法将它们成功导入番茄品种中蔬5号中。获得卡那霉素抗性植株14棵,提取部分T0代转化番茄PCR阳性植株的基因组DNA,经Southern杂交分析,证明载体的T-DNA区段已经整合到番茄基因组中,拷贝数1-3个不等。2.T0代转化番茄中有两棵植株的果实在成熟时果实色泽表现出明显的改变,成熟果实呈黄色,对照的非转化植株成熟果实则为红色。对T0代番茄果实进行了色差值的测定,发现多数转基因果实相对于对照偏黄。通过HPLC（高效液相色谱）测定黄色转基因果实的色素成分和比例发现,其β-胡萝卜素的含量极显著的高于对照,而番茄红素的含量则显著低于对照。说明转基因植株中,外源β-环化酶基因（Lcyb）确实超量表达,致使番茄红素大量向β-胡萝卜素转化,导致果实积累β-胡萝卜素而呈现出黄色。3.提取部分T0代转化番茄PCR阳性植株的RNA,通过RT-PCR检测外源基因的相对表达量,14株转基因植株中有8株检测到目的基因的表达,表达量各有高低。通过Real-time PCR检测转基因植株果实中其他色素代谢相关基因的表达情况,发现在色素代谢途径中,位于Lcyb基因上游的基因在转基因植株中的表达量普遍降低,而位于Lcyb基因下游的基因在转基因植株中的表达量上升。4.对Southern杂交检测的阳性植株,收获T1代种子。对T1世代植株PCR扩增分析鉴定,发现单拷贝的植株NPTⅡ基因分离符合1:3的比例。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 柑橘红肉突变体的相关研究进展
• 1.2.1.1 柑橘红肉突变体中的主要呈色色素
• 1.2.1.2 柑橘红肉突变体的变异原因
• 1.2.2 高等植物类胡萝卜素合成相关基因的研究进展
• 1.2.2.1 类胡萝卜素生物合成途径
• 1.2.2.2 类胡萝卜素生物合成关键酶基因的研究进展
• 1.2.3 果树基因克隆及功能验证方法研究进展
• 1.2.3.1 功能克隆法
• 1.2.3.2 同源序列法
• 1.2.3.3 表达序列标签
• 1.2.3.4 cDNA-AFLP技术
• 1.2.3.5 果树基因的功能验证
• 1.2.4 农杆菌介导番茄遗传转化研究进展
• 1.2.4.1 农杆菌介导法的转化机理
• 1.2.4.2 影响农杆菌介导番茄遗传转化因素
• 1.2.5 番茄红素β-环化酶（Lcyb）基因转化番茄的研究进展
• 1.3 本研究的目的及内容
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 细菌材料
• 2.2 主要试剂和仪器
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.3 引物设计
• 2.3.1 PCR引物序列
• 2.3.2 RT-PCR引物序列
• 2.3.3 Real-time PCR引物序列
• 2.4 农杆菌介导的Lcyb基因转化番茄
• 2.5 转基因番茄植株的分子检测
• 0代转化植株的分子检测'>2.5.1 T₀代转化植株的分子检测
• 2.5.1.1 番茄转化再生植株的DNA提取
• 2.5.1.2 转化再生番茄植株的PCR检测
• 0代转基因番茄植株的Southern杂交检测'>2.5.1.3 T₀代转基因番茄植株的Southern杂交检测
• 1代转基因番茄植株的分子鉴定'>2.5.2 T₁代转基因番茄植株的分子鉴定
• 0代转基因番茄果实色差值的测定'>2.6 T₀代转基因番茄果实色差值的测定
• 0代转基因番茄果实类胡萝卜素成分和含量的测定'>2.7 T₀代转基因番茄果实类胡萝卜素成分和含量的测定
• 0代转基因番茄果实外源基因表达情况'>2.8 RT-PCR检测T₀代转基因番茄果实外源基因表达情况
• 0代转基因番茄果实RNA提取'>2.8.1 T₀代转基因番茄果实RNA提取
• 0代转基因番茄果实外源Lcyb基因表达情况'>2.8.2 RT-PCR检测T₀代转基因番茄果实外源Lcyb基因表达情况
• 0代转基因番茄植株中内源类胡萝卜素合成相关基因的表达'>2.9 Real-time PCR检测T₀代转基因番茄植株中内源类胡萝卜素合成相关基因的表达
• 3 结果与分析
• 3.1 转基因番茄植株的获得
• 3.2 转基因番茄植株的分子鉴定
• 0代转基因植株PCR检测分析'>3.2.1 T₀代转基因植株PCR检测分析
• 3.2.2 转基因番茄植株的Southern杂交分析
• 3.2.3 转基因植株后代的遗传分析
• 0代转基因番茄果实色差值的测定'>3.3 T₀代转基因番茄果实色差值的测定
• 0代转基因番茄果实类胡萝卜素成分和含量的变化'>3.4 T₀代转基因番茄果实类胡萝卜素成分和含量的变化
• 0代转基因番茄果实中类萝卜素的成分'>3.4.1 T₀代转基因番茄果实中类萝卜素的成分
• 0代转基因番茄果实中类胡萝卜素含量的变化'>3.4.2 T₀代转基因番茄果实中类胡萝卜素含量的变化
• 3.5 转基因番茄果实中外源Lcyb基因的表达分析
• 0代转基因番茄植株中类胡萝卜素合成相关基因的表达分析'>3.6 T₀代转基因番茄植株中类胡萝卜素合成相关基因的表达分析
• 4.讨论
• 4.1 红肉脐橙中Lcyb基因两个转录本的功能分析
• 4.2 Lcyb基因与红肉脐橙色泽突变的关系
• 4.3 基于本研究的后续工作
• 4.4 类胡萝卜素代谢基因工程在园艺植物育种中的应用前景
• 参考文献
• 图版与图版说明
• 致谢