脂肪酶固定化及其在化学品合成中的应用

论文摘要

脂肪酶催化具有条件温和、选择性高和环境友好的优点,是国内外化学工业绿色合成的一个重要热点领域。为了开发廉价并且高效的工业固定化酶,本文研究了用天然蚕丝纤维织物固定化假丝酵母脂肪酶Candida sp.99-125及其在多种化学品合成中的应用。作为绿色化学技术中非常活跃的前沿领域,离子液体（ILs）作为“绿色”溶剂在生物合成中的应用日益广泛。本文同时研究了离子液体在脂肪酶催化的油脂加工中的应用。主要工作如下：1.氨基硅油整理纤维织物固定化脂肪酶：织物亲/疏水性对固定化酶活性和稳定性的影响载体表面的微环境,尤其是表面亲疏水性质是影响固定化酶活性的重要因素之一。本文选取天然的蚕丝纤维织物-绵绸为载体,首次将纺织工业中织物整理技术对纤维织物的疏水整理与固定化酶相结合,采用氨基硅油对绵绸织物进行表面改性后吸附固定化脂肪酶。氨基硅油整理后,在织物表面引入甲基基团,为固定化酶提供了一个适度的疏水微环境,参与于脂肪酶的界面活化,提高了固定化酶的活性和稳定性。与整理前的载体相比,疏水整理织物橄榄油水解活力提高了1.6-2倍,酯化活力提高了3-4倍。本文详细的比较了整理前后织物固定化酶的性质如pH、温度和有机溶剂耐受性等。并且研究了固定化酶在有机相酯化系统中的反应特性和操作稳定性。结果发现,未整理的织物固定化酶对酯化系统的含水量有明显的依赖,最适初始加水量为1.5%。而疏水织物固定化酶能够在15%高水含量的酯化体系保持高活性。在十二酸十二酯的酯化合成体系中,疏水织物固定化酶的长期操作稳定性明显优于未整理织物固定化酶,连续反应27批后,酯化率维持97%以上。另外,本文还通过表面接触角测定、扫描电镜（SEM）、衰减全反射傅立叶变换红外分析（ATR/FT-IR）以及X-射线光电子能谱分析（XPS）对氨基硅油整理后的织物表面性质和化学组成进行了表,征。2.发酵液固定化脂肪酶及无溶剂体系生物柴油（油酸乙酯）的酶法合成固定化酶的制备成本高是限制其大规模生产及应用的关键因素。为了降低固定化酶的成本,本文以绵绸织物为载体,开发了通过直接浸渍脂肪酶发酵液制备固定化酶的工艺,并且通过无溶剂体系中油酸和乙醇的酯化反应来评价发酵液固定化脂肪酶的活性及使用稳定性。本文优化了固定化操作的参数条件,如发酵液酶活单位、pH值、吸附时间和次数等因素。结果表明,通过10-30min短时间浸渍后,固定化酶便具有较高的酯化活力,油酸乙酯合成转化率达到80%。织物载体可以对发酵液进行反复多次的浸渍,并且多次吸附制备的固定化酶重复使用的稳定性高于单次吸附。进一步优化了无溶剂系统中油酸乙酯的合成反应条件,对乙醇和水对脂肪酶活性的影响进行了研究。最终的优化条件为：2.42g油酸,乙醇和油酸的摩尔比为1：1,9%（w/w）的固定化酶用量,通过乙醇流加和水的去除,30℃下反应24h,酯化率可以达到90%,该条件下固定化酶反应的半衰期超过30天。实验结果表明,绵绸织物直接吸附发酵液得到的固定化酶具有优良的活性和稳定性,同时发酵液固定化过程也省去了酶的分离和纯化工序,降低了固定化的成本。3.织物膜固定化酶反应器的构建及其在棕榈酸异辛酯合成中的应用纤维材料作为固定化载体,可以以不同的形式满足生物反应器设计的要求,如片状、束状和织物膜状。本文针对纤维织物的特点,构建了织物膜固定床式酶反应器。固定化酶织物膜覆盖在不锈钢丝网上卷绕成螺旋卷筒状,填充入反应柱（L：280mm,1D：50mm）中,并且应用该反应器进行了酯化合成棕榈酸异辛酯的研究。投料250g棕榈酸、165g异辛醇、酸醇底物摩尔比为1：1.3,1500mL石油醚作为反应溶剂、固定化酶130g,40℃下反应6h,酯化率达到95-97%。研究了保留时间,酶反应柱高径比、酯化过程中产生的水等相关参数对酶反应的影响。结果表明,织物载体的高空隙率有利于降低扩散阻力。而反应体系中水的累积影响固定化酶活性,导致批次反应初速率的降低。通过串联分子筛柱不断移除反应生成的水分,有利于固定化酶活力的保持,最终酯化率达到98.7%,9个批次后相对反应初速率保留值为94%。固定化酶反应器显示出良好的操作稳定性,批次反应连续进行32批,酯化率保持在95%以上。4.固定化酶催化合成脂肪族二元酸酯脂肪族二元酸酯是耐寒增塑剂和环境友好润滑油的主要原料,目前工业的生产方法均为化学法。本文以自制的织物膜固定化脂肪酶为催化剂,研究了脂肪族二元酸酯的酯化合成工艺。以癸二酸、壬二酸和己二酸为原料,分别考察了二元酸与C4-C18的15种饱和正醇的酯化反应。结果表明,癸二酸和壬二酸的酯化效果优于己二酸。以癸二酸和异辛醇的酯化为模型反应,优化了酶反应条件。在40℃下,lmmol二元酸,酸醇底物摩尔比1：3,酶用量为1000U（0.2g）,0.5g变色硅胶作为吸水剂除去反应生成的水,反应24h,癸二酸的最终酯化率达到97%。该反应连续进行40批次,酯化率保持在96%.在同样的优化条件下,通过三种二元酸与不同醇的酯化来合成10余种不同的二元酸酯,酯化率均达到95%以上。5.离子液体结构对酶法甘油解反应转化率和选择性的影响：COSMO-RS计算用于理论表征通过溶剂工程调节来强化反应过程,提高目标产物的平衡产率一直是化学家追求的目标。但是对于酶法甘油解合成单甘酯的工艺而言,由于传统的溶剂缺乏有效和足够的溶剂作用,一直难于解决油脂和甘油相容性差以及单甘酯平衡产率低的问题。本文以固定化脂肪酶Novozym435为催化剂,选用了一系列不同结构（特别是具有不同的阳离子功能结合基团）的季铵盐型离子液体（ILs）作为溶剂,研究了三油酸甘油酯的甘油解反应行为。研究发现,CPMA.MS和Ammoeng102两种具有类似阳离子结构的ILs,获得99%的油脂转化率和大于90%的单甘酯产率,其反应特征完全不同于传统的有机溶剂体系。提出了阳离子结构中同时存在的疏水和亲水性功能取代基团决定了甘油解反应特性和选择性的作用机理：长链的疏水烷基或酰基能够明显的改善油脂的溶解度并且提高初始反应速率,而极性基团如游离的羟基和乙氧基等能够降低产物的热力学活性,进而相应的改变反应平衡和产物的选择性。为了更好的描述ILs中多种复杂的溶剂作用对反应的影响,通过真实溶剂的类导体屏蔽模型COSMO-RS计算得到了油脂在不同结构ILs的溶解度、范德华力作用能和不匹配作用能,反应产物单甘酯、二甘酯在不同ILs中的化学势和诱活度系数决定的平衡常数等,进而结合ILs结构特征和相应反应行为,量化的描述了不同功能结构基团对反应特性的贡献。该结果同时也将有助于我们在分子水平上理解离子液体结构与功能的关系。

论文目录

• 学位论文数据集
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 脂肪酶概述
• 1.2 脂肪酶的结构及构象特征
• 1.2.1 脂肪酶的活性中心结构
• 1.2.2 脂肪酶的多构象特征与界面活化
• 1.3 脂肪酶在化学品合成的应用
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 棕榈酸异辛酯的合成
• 1.3.3 二元酸酯的酶法合成
• 1.3.4 单甘酯的合成
• 1.3.4.1 单甘酯的化学法合成
• 1.3.4.2 单甘酯的酶法合成
• 1.3.5 生物柴油的酶法合成
• 1.4 脂肪酶的固定化
• 1.4.1 固定化材料
• 1.4.1.1 颗粒载体
• 1.4.1.2 膜材料
• 1.4.1.3 纤维材料
• 1.4.2 固定化方法
• 1.4.2.1 传统的固定化方法
• 1.4.2.2 疏水界面活化固定化酶
• 1.4.2.3 硅基质包埋方法
• 1.4.2.4 交联酶晶体法
• 1.4.2.5 定点固定化技术
• 1.5 非水相脂肪酶催化
• 1.5.1 水对脂肪酶催化反应的影响
• 1.5.2 溶剂对脂肪酶催化反应的影响
• 1.6 离子液体中酶催化研究进展
• 1.6.1 离子液体的结构和分类
• 1.6.2 离子液体的作为生物催化反应溶剂的特性
• 1.6.3 脂肪酶在离子液体中的催化特征
• 1.7 COSMO-RS模型简介
• 1.8 本课题研究思路和内容
• 参考文献
• 第二章 氨基硅油整理纤维织物固定化脂肪酶：织物亲/疏水性对固定化酶活性和稳定性的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.0 实验材料
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 仪器与设备
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 织物的表面疏水整理
• 2.2.3.2 戊二醛活化载体的方法
• 2.2.3.3 脂肪酶固定化程序
• 2.2.3.4 脂肪酶负载量测定方法
• 2.2.3.5 水解酶活的定义和测定方法
• 2.2.3.6 固定化酶酯化活力的定义和测定方法
• 2.2.3.7 织物膜表面水接触角的测定方法
• 2.2.3.8 扫描电镜（SEM）观察织物膜表面形貌
• 2.2.3.9 织物膜表面的衰减全反射傅立叶变换红外分析
• 2.2.3.10 织物膜表面X-射线光电子能谱分析（XPS）
• 2.2.3.11 pH对固定化酶活力的影响
• 2.2.3.12 温度对固定化酶活力的影响
• 2.2.3.13 甲醇和乙醇浓度对固定化酶活力的影响
• 2.2.3.14 固定化酶在有机溶剂中的稳定性
• 2.2.3.15 酯化反应体系含水量对固定化酶活性的影响
• 2.2.3.16 固定化酶在酯化反应体系中的操作稳定性
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 疏水整理剂的选择及整理后织物表面接触角比较
• 2.3.2 氨基硅油整理织物的表面结构表征
• 2.3.2.1 氨基改性硅油的基本结构
• 2.3.2.2 氨基硅油整理后的织物表面性质表征
• 2.3.2.2.1 纤维织物的表面SEM分析
• 2.3.2.2.2 氨基硅油整理织物的表面ATR-FT/IR分析
• 2.3.2.2.3 氨基硅油整理织物的表面XPS分析
• 2.3.3 疏水整理对固定化酶水解酶活的影响
• 2.3.4 疏水整理对固定化酶酯化活力的影响
• 2.3.5 氨基硅油整理织物固定化酶的SEM分析
• 2.3.6 氨基硅油用量对固定化酶酶活的影响
• 2.3.7 疏水织物固定化酶的性质
• 2.3.7.1 pH值对固定化酶活力影响
• 2.3.7.2 温度对固定化水解活力的影响
• 2.3.7.3 有机溶剂对固定化酶活性和稳定性的影响
• 2.3.8 疏水织物固定化酶在酯化体系中反应特性和操作稳定性
• 2.3.8.1 高水含量体系中固定化酶的活性
• 2.3.8.2 固定化酶的操作稳定性
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 发酵液固定化脂肪酶及无溶剂体系中生物柴油（油酸乙酯）的酶法合成
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 仪器与设备
• 3.2.4 实验方法
• 3.2.4.1 脂肪酶发酵液的酶活测定
• 3.2.4.2 发酵液吸附固定化脂肪酶
• 3.2.4.3 无溶剂体系油酸乙酯的酯化合成
• 3.2.4.4 固定化酶批次反应稳定性测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 发酵液固定化过程的研究思路
• 3.3.2 固定化过程参数优化及控制
• 3.3.2.1 发酵液酶活单位对固定化的影响
• 3.3.2.2 吸附时间对固定化的影响
• 3.3.2.3 吸附次数对固定化的影响
• 3.3.2.4 发酵液pH值对固定化的影响
• 3.3.3 无溶剂体系油酸乙醇酯化过程优化
• 3.3.3.1 温度对酯化的影响
• 3.3.3.2 酶用量对酯化的影响
• 3.3.3.3 底物摩尔比对酯化的影响
• 3.3.3.4 乙醇流加对酯化的影响
• 3.3.3.5 水对酯化的影响
• 3.3.3.6 固定化酶的稳定性
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 织物膜固定化酶反应器的构建及其在棕榈酸异辛酯合成中的应用
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器设备
• 4.2.4 实验方法
• 4.2.4.1 脂肪酶的发酵生产
• 4.2.4.2 脂肪酶的固定化
• 4.2.4.3 固定床反应器中棕榈酸异辛酯的合成
• 4.2.4.4 反应酯化率的测定
• 4.2.4.5 水含量的测定
• 4.2.4.6 产物的气相色谱（GC）分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 固定床式酶反应器的构建
• 4.3.2 底物浓度对酯化的影响
• 4.3.3 底物摩尔比对酯化的影响
• 4.3.4 保留时间对酯化的影响
• 4.3.5 反应柱高径比的影响
• 4.3.6 酶反应器中水量对酯化的影响
• 4.3.7 固定床式酶反应器的操作稳定性
• 4.3.8 产物的分离纯化和分析
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第五章 固定化酶催化合成脂肪族二元酸酯
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 仪器与设备
• 5.2.4 实验方法
• 5.2.4.1 自制Candida sp99-125假丝酵母固定化脂肪酶的制备
• 5.2.4.2 酶活的定义和测定方法
• 5.2.4.3 二元酸酯的酯化合成
• 5.2.4.4 二元酸酯化率的测定
• 5.2.4.5 产物分离纯化
• 5.2.4.6 气相色谱分析
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 酶的选择
• 5.3.2 底物对酯化的影响
• 5.3.4 有机溶剂的影响
• 5.3.5 温度的影响
• 5.3.6 酶用量的影响
• 5.3.7 吸水剂对酯化的影响
• 5.3.8 底物摩尔比的影响
• 5.3.9 固定化酶反应的稳定性
• 5.3.10 产物的分析
• 5.3.11 其他二元酸酯的酯化合成
• 5.4 小结
• 参考文献
• 第六章 离子液体结构对酶法甘油解反应转化率和选择性的影响：COSMO-RS计算用于理论表征
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 实验主要试剂
• 6.2.3 主要仪器及分析程序
• 6.2.4 实验方法
• 6.2.4.1 离子液体中脂肪酶催化的甘油解反应
• 6.2.4.2 薄层色谱（TLC-FID）分析
• 6.2.4.3 无限稀释活度系数和溶解度的计算：模型理论和计算分析
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 不同结构离子液体中甘油解反应行为比较
• 6.3.2 离子液体结构影响单甘酯合成选择性的作用机理分析
• 6.3.3 温度对离子液体中甘油解反应的影响
• 6.3.4 离子液体用量对甘油解反应的影响
• 6.3.5 底物摩尔比（Gly/TG）对甘油解反应的影响
• 6.3.6 离子液体对脂肪酶活性的影响
• 6.3.7 COSMO-RS模型对离子液体结构决定反应特性的量化分析
• 6.3.7.1 σ-Profiles与σ-Potentials
• 6.3.7.2 底物溶解度与范德华力作用能和不匹配作用能
• 6.3.7.3 活度系数与产物选择性
• 6.4 小结
• 参考文献
• 第七章 结论
• 本论文创新点
• 问题与建议
• 附录
• 研究成果及发表的学术论文
• 致谢
• 作者和导师简介
• 博士研究生学位论文答辩委员会决议书