论文摘要
目的:寻找适合原子力显微镜（Atomic force microscopy , AFM ）观察甲状腺活体组织细胞标本的最佳制备方法;应用AFM观察甲状腺正常滤泡上皮细胞、腺瘤细胞和癌细胞的细胞膜表面超微结构,为甲状腺正常细胞和肿瘤细胞膜表面超微结构积累形态学信息,以期为临床的滤泡性肿瘤的良恶性鉴别诊断提供向导。方法:采用实验室常用的细胞提取方法即压片组织细胞法、细胞印片法和酶消化离心涂片法制备适合于AFM观察的活体甲状腺组织细胞样品,对比观察三种方法所制备的细胞样品在光学显微镜和AFM下（Tapping模式）的细胞分散度和图像清晰度,找出适合AFM观察甲状腺活体组织细胞样品的最佳制备方法。以甲状腺正常滤泡上皮细胞、腺瘤细胞和癌细胞各300个为研究对象,采用细胞印片法获取甲状腺细胞样品,应用AFM（Tapping模式）对三者进行扫描并采用软件分析系统进行分析,然后利用SPSS11.5统计分析软件对所测得的三类细胞膜表面平均粗糙度（mean roughness）、平均峰高度（Average Max peak height）、平均凹陷深度（Average Maximum depth）和表面积差值（surface area difference）进行统计,比较三者是否具有统计学意义。结果:压片组织细胞法制备的甲状腺细胞样品经H.E染色,视野中可见较多的血液和组织液,大量细胞重叠成片排列。AFM扫描时这些重叠成片的细胞索影响单个细胞的观察,很难呈现出清晰、真实的AFM图像;细胞印片法制备的甲状腺细胞样品经H.E染色,视野中背景较干净,细胞分散度较好,可见较多单个散在的细胞。AFM扫描时,很容易找到单个细胞,杂质较少、干扰较小且成像清晰;酶消化离心涂片法制备的甲状腺细胞样品经H.E染色,视野中细胞背景较杂,出现大量的裸核细胞及少量的细胞团块。AFM扫描时细胞表面的杂质较多、干扰较大,图像极不清晰。应用AFM对比观察正常甲状腺滤泡上皮细胞、腺瘤细胞和癌细胞三者的膜表面超微结构,发现正常甲状腺滤泡上皮细胞在扫描范围为20μm时其形状呈圆形,直径10～14μm,而腺瘤细胞和癌细胞形状略不规则,比正常细胞稍大,膜表面较粗糙,但更加微细的结构在此扫描范围还观察不到。随着扫描范围的逐渐缩小,分辨率逐渐增大,细胞膜表面的超微结构也逐渐清晰。尽管三者膜表面均表现为凹凸不平的“山峦样”隆起,但隆起的数量、体积、形态上各有差别。正常甲状腺细胞表面的隆起较光滑,分布均匀、形状规则,排列疏密适中。隆起物平均大小为27.52×36.85nm,Z轴高度平均为32.37nm;腺瘤细胞表面的隆起较正常细胞粗糙,分布不均匀、形状渐不规则,排列开始紊乱。隆起物之间出现裂隙,呈“沟渠状”,裂隙间相互贯通。隆起物平均大小为54.74×41.98nm,Z轴高度平均为51.37nm,裂隙平均深度为-59.71nm;癌细胞的膜表面则更加粗糙,隆起物分布更加不均匀、形状极不规则,有的隆起呈“尖刀状”,有的隆起呈“馒头状”,排列已经参差不齐,隆起物之间的裂隙比腺瘤细胞更宽更深,呈“沟壑状”,隆起物的宽度和高度均明显增加,隆起物平均大小达67.42×54.38nm,Z轴高度平均为58.86nm,裂隙平均深度为-78.04nm。采用AFM的软件分析系统对三者细胞膜表面的重要参数进行测量得知,正常细胞膜表面的平均粗糙度（mean roughness）、平均峰高度（Average Max peak height）、平均凹陷深度（Average Maximum depth）和表面积差值（surface area difference ）分别为12.505±5.307、25.827±3.764、-17.837±2.276和3.794.±1.030,腺瘤细胞膜表面的测量值分别为45.870±3.638,51.838±5.941,-58.340±4.812和11.305±2.996,而癌细胞膜表面的测量值分别为57.936±3.769 , 62.582±8.106 , -81.649±9.808和13.351±6.734。采用SPSS 11.5统计分析软件对所测得的三者细胞膜表面平均粗糙度、平均峰高度、平均凹陷深度和表面积差值的数据进行统计学处理,结果三者在膜表面平均粗糙度、平均峰高度、平均凹陷深度和表面积差值的比较上均具有统计学意义。结论:采用细胞印片法制备的甲状腺细胞样品,因其背景干净、胶质较少、细胞分散度较好和图像清晰的特点成为最适合AFM观察甲状腺细胞的样品制备方法。正常甲状腺滤泡上皮细胞、腺瘤细胞和癌细胞的细胞膜表面超微结构在AFM下的成像表现出明显差异,可以为临床鉴别甲状腺滤泡性肿瘤良、恶性提供帮助和指导。
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