论文摘要
论文一复杂多并指（趾）畸形遗传定位及致病突变分析非综合征型并指（趾）畸形是人类最常见的肢端畸形,多呈常染色体显性遗传。Temtamy与McKusick按临床表现将非综合征型并指（趾）分为五型。其中Ⅳ型并指（syndactyly typeⅣ,SD4;MIM 186200）又称Haas型并指,主要表现为双侧完全性皮肤并指,多伴有第6根掌骨及手指多指现象,常常由于筋腱挛缩整个手呈杯状结构,但不存在骨性融合;通常下肢受累较轻,偶见伴发胫侧半肢畸形。三节指节拇指—多并指综合征（triphalangeal thumb-polysyndactyly syndrome,TPTPS;MIM174500）是一种呈常染色体显性遗传的肢端畸形,表现为在第1指即大拇指的位置出现一个或多个具有三节指节的类似大拇指结构,同时存在第3-5指全并指或第4-5指并指,而第2指往往受累较轻;通常下肢受累较轻。在胚胎早期肢端发育过程中,极化活性区（zone of polarizing activity,ZPA）分泌的Shh蛋白决定了指趾数目及形态,而人类SHH基因位于染色体7q36区域。人类染色体7q36区域与肢端发育密切相关,目前定位于此的肢端畸形有:轴前多指/三节指节拇指（preaxial polydactyly/triphalangeal thumb,PPD/TPT;MIM 174500）,TPTPS,SD4及胫侧半肢-多并指-三指节拇指综合征（tibial hemimelia-polysyndactyly-triphalangeal thumbs syndrome,THPTTS;MIM 188770）,无手足畸形（acheiropodia,ACHR;MIM 200500）,肢胸综合征（acropectoral syndrome,ACRPS;MIM 605967）。其中PPD/TPT,TPTPS及THPTTS都存在三指节拇指的表型。有趣的是,1999年,Heus等人将PPD/TPT致病基因的关键区域缩小到450kb并排除了SHH基因。Lettice等通过比较基因组和转基因动物的遗传定位分析实验发现,此区域内Lmbr1/C7orf2（limb region 1）基因第5内含子中存在大约800bp的ZPA调控序列（ZPA regulatory sequence,ZRS）,在它控制下的LacZ报告基因在肢芽后缘ZPA区域有特异性表达。随后,研究人员在8个人类PPD/TPT家系受累个体,3个PPD突变鼠模型及3个携带多趾表型的猫的ZRS内发现了不同的点突变,证实了ZRS作为SHH增强子在PPD/TPT中的致病作用。在一个泰国TPTPS家系中,TPTPS表型患者、SD4伴胫侧半肢畸形表型患者共存的事实提示,TPT、TPTPS、SD4和THPTTS可能有着相似的遗传致病机制。拷贝数变异（copy number variation,CNV）是指基因组中＞1kb的DNA片段存在拷贝数目变化的现象,通常包括插入、缺失和重复。研究发现,CNV在基因组中普遍存在,与每300bp就可出现一次的单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism,SNP）相比,CNV所涉及的DNA序列范围更为广泛,大概覆盖12%的人类基因组的序列。CNV与人类疾病发生密切相关,当基因组中由于CNV的存在,引起一些剂量敏感基因发生缺失、重复或者结构完整性破坏时,就会导致基因组疾病（genomicdisorder）的发生。本研究以6个中国人TPTPS/SD4家系为对象,家系1的患者具有典型的TPTPS手部畸形,家系2、3、4、6中TPTPS/SD4表型并存,家系5表现为典型的SD4。我们针对7q36区域,在4个家系中进行两点连锁分析,结果当θ=0时,在位于LMBR1基因内的遗传标记TG处获得最大累计LOD值为17.32,其中家系1为9.52,家系2为3.72,家系3为2.65,家系4为1.43,肯定连锁。首次在中国人TPTPS/SD4家系中确认了TPTPS/SD4致病基因定位于染色体7q36。我们通过单倍型分析将TPTPS/SD4致病基因定位至微卫星标记AGAA至AATT之间约647kb、不包含SHH因的范围内。前期工作中,我们对TPTPS/SD4连锁区域内的候选基因及10个物种间高度保守的非编码序列（包括ZRS）进行测序,结果没有发现致病性序列改变。本研究中,通过回顾分析测序图谱,我们发现患者当中位于高度保守非编码区4内和ZRS内的两个SNP（rs11976306,rs10254391）存在等位基因不平衡现象;对更多患者和家系内正常个体的测序结果显示,该现象与疾病表型共分离,提示在该区域内可能存在与TPTPS/SD4相关的DNA拷贝数增加。我们通过实时定量PCR分析发现6个TPTPS/SD4家系中都存在ZRS拷贝数增加,并应用荧光原位杂交技术直接在患者间期核中观察到了该段DNA重复现象。Ssq小鼠的转基因插入位点也存在包含鼠ZRS在内的24kb的DNA重复,进一步证明了ZRS拷贝数增加的致病性。我们在647kb的TPTPS/SD4连锁范围内,综合运用实时定量PCR技术和Affymetrix SNP 6.0芯片,对家系1-6患者的重复突变断端边界进行了精细定位,并据此成功克隆了家系1、3和5的断裂接合片段。根据以上分析,家系1、3、5患者的重复突变范围确定为:144859bp、216761bp和324189bp;而家系2、4、6患者的DNA最小重复范围约为379kb、294kb和398kb。分析家系1、3、5患者重复突变断端区域基因组序列及结构特征,我们提出家系1患者重复突变的形成机制可能是非等位基因同源重组（nonallelic homologousrecombination,NAHR）和非同源断端连接机制（nonhomologous end-joining,NHEJ）或复制叉停顿和模板转位机制（fork stalling and template switching,FosTes）。家系3和家系5患者重复突变的形成机制可能是非同源断端连接机制（nonhomologousend-joining,NHEJ）。总之,我们在6个中国人TPTPS/SD4家系中确认了TPTPS/SD4致病基因位于染色体7q36区域一个约647kb的区间内;发现TPTPS/SD4致病突变是包含ZRS在内的DNA重复突变;患者表型严重程度与重复片段大小无直接关系;基于对本研究中6个TPTPS/SD4家系中患者表型的分析及分子遗传学发现,结合文献分析,我们提出PPD/TPT、TPTPS、SD4和THPTTS是一个连续的表型谱的概念。论文二视网膜母细胞瘤中RB1基因致病突变检测RB1（Retinoblastoma 1,RB1;MIM 180200）基因突变是视网膜母细胞瘤发生中的起始基因缺陷。视网膜母细细胞瘤分遗传性和非遗传性两种,几乎所有的双侧和家族性患者都是遗传性视网膜母细胞瘤。只有15%的单侧视网膜母细胞瘤患者是遗传性的,其余都是非遗传性的散发病例。遗传性视网膜母细胞瘤患者携带生殖系RB1基因突变,RB1基因生殖系突变的检测有助于遗传性视网膜母细胞瘤患者的确认和其高危亲属中携带者的检出,从而提供相应的遗传咨询。迄今,已发现了近600种来自不同种族背景的RB1基因突变,根据一项RB1基因突变的meta分析报告,来自中国人群的突变仅有22种。本研究中,我们首先应用变性高效液相色谱（High-Performance LiquidChromatography,DHPLC）或高分辨熔解曲线分析（High Resolmion Melting,HRM）做为初筛工具,结合测序验证,我们对31名中国汉族视网膜母细胞瘤患者进行了RB1基因外显子及邻近内含子区域的微小缺陷（micro-lesion）的突变筛查。对于在上述筛查中的阴性个体,我们进行了多重连接探针扩增分析（multiple ligation probeamplification,MLPA）,对RB1基因外显子或包含整个RB1基因的拷贝数变异进行检测。对基因组DNA水平上RB1基因突变检测阴性个体,我们进行了转录本分析,检测存在于内含子当中的剪接位点突变或大的重组造成的剪接改变。我们在19名遗传性视网膜母细胞瘤患者中发现了18种RB1基因突变,其中10个为国际首报。我们发现的新突变包括6个移码突变（p.Leu647HisfsX10,p.Asn598LysfsX13,p.Gly310ValfsX6,p.Glu746GlyfsX3,p.Ser393LysfsX2,p.Val314PhefsX2）,一个通过外显子跳跃导致提前出现终止密码（p.Thr841X）的剪接位点突变（c.2663+1G＞A）,2个包含整个RB1基因的缺失突变,缺失范围分别约为3Mb和10Mb;另外,我们在RNA水平上检测到一个RB1基因15、16和17外显子缺失突变（p.Glu464Ser565del）,但造成这一剪接异常的DNA水平上的突变仍未确定。通过RB1基因检测,我们为31个家庭提供了遗传咨询;并通过检测绒毛、羊水或脐血DNA中的RB1基因突变,为12名孕妇进行了产前基因检测,检出1例携带RB1基因突变的胎儿。综上,我们的研究丰富了中国人的RB1基因突变谱。经实践证明,我们利用多种方法组合进行RB1基因突变筛查的策略灵敏有效,在19名遗传性视网膜母细胞瘤患者中RB1基因突变检出率达到100%,从而使RB1基因突变筛查有可能成为视网膜母细胞瘤患者的医疗方案的一个组成部分。
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