猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及ApxⅠA、TbpB基因的克隆和原核表达研究

论文摘要

从四川省爆发猪传染性胸膜肺炎的某猪场病猪中,分离到了一株细菌。通过形态学,血清学,分子生物学试验,鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌1型,命名为APP-CYY。药敏试验结果:对四环素、头孢三嗪、氟哌酸、复方新诺明、丙氟哌酸敏感;对卡那霉素、丁氨卡那、先锋霉素Ⅳ、万古霉素、氨苄青霉素、庆大霉素耐药。PCR鉴定根据国外报道,猪胸膜肺炎放线杆菌高度保守的弱溶血毒素APXⅣA基因序列,设计的引物,扩增到了预期大小442bp的核苷酸片段。根据已发表的猪传染性胸膜肺炎血清1型ApxⅠA（NCBI登陆号:X68595）和TbpB（NCBI登陆号:U16019）基因序列设计合成特异性引物,以分离APP-CYY菌株基因组DNA为模板,分别扩增出了预期约3089bp和736bp的目的片段,然后分别连接到pMD18-T载体中,构建了重组质粒pMD18-T-ApxⅠA和pMD18-T-TbpB,重组质粒经酶切鉴定和序列分析表明为ApxⅠA和TbpB基因。该基因包括猪ApxⅠA和TbpB基因全部开放阅读框,将所获得的猪传染性胸膜肺炎血清1型ApxⅠA基因序列,同Genbank上有报道性胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、9、10型ApxⅠA基因之间进行同源性比较,同源性在96.8-98.8%之间。测定的TbpB基因序列,仅与GenBank数据库中的两条猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型TbpB基因序列具有较高的同源性,分别为99.7%和99.6%。运用鉴定正确的重组质粒pMD18-T-ApxⅠA和pMD18-T-TbpB,酶切回收了ApxⅠA和TbpB基因片段,并分别插入原核表达载体pET32a（+）,构建原核表达质粒pET32a（+）-ApxⅠA和pET32a（+）-TbpB。在大肠杆菌BL21中进行诱导,分别表达了ApxⅠA（125 Kd）和TbpB（44 Kd）的蛋白,经鉴定此蛋白与预期的胸膜肺炎放线杆菌的ApxⅠA和TbpB大小相同。Western blotting分析显示均可与胸膜肺炎放线杆菌阳性血清1型发生反应。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 病原学
• 1.1 血清型
• 1.2 生化特征
• 1.3 APP培养特性
• 1.4 主要毒力因子
• 1.4.1 Apx毒素
• 1.4.2 荚膜多糖
• 1.4.3 脂多糖
• 1.4.4 外膜蛋白
• 1.4.5 转铁结合蛋白
• 2 诊断方法
• 2.1 血清学诊断方法
• 2.1.1 补体结合试验
• 2.1.2 酶联免疫吸附试验
• 2.1.3 凝集试验
• 2.1.4 环状沉淀试验
• 2.1.5 间接血凝试验
• 2.1.6 间接荧光抗体试验
• 2.1.7 乳胶凝集试验
• 2.1.8 免疫扩散试验
• 2.1.9 用免疫磁化法来分离菌株
• 2.2 分子生物学诊断
• 2.2.1 PCR技术
• 2.2.2 核酸探针检测技术
• 3 猪胸传染性膜肺炎疫苗研究进展
• 3.1 灭活疫苗
• 3.2 活疫苗
• 3.3 亚单位疫苗
• 3.4 基因工程缺失苗
• 试验一 猪胸膜肺炎放线杆菌四川株的分离鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 病料来源
• 1.1.3 溶液配制
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌分离
• 1.2.2 形态学观察
• 1.2.3 CAMP试验
• 1.2.4 NAD需求试验
• 1.2.5 血清型鉴定
• 1.2.6 生化试验
• 1.2.7 药敏试验
• 1.2.8 动物试验
• 1.2.9 PCR鉴定
• 2 结果
• 2.1 剖检结果
• 2.2 培养特性
• 2.3 形态学观察
• 2.4 血清型鉴定
• 2.5 生化鉴定结果
• 2.6 药敏试验结果
• 2.7 动物试验结果
• 2.8 PCR鉴定结果
• 3 讨论
• 3.1 关于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离
• 3.2 关于猪传染性胸膜肺炎的生化鉴定
• 3.3 关于猪传染性胸膜肺炎的药敏试验
• 3.4 关于猪传染性胸膜肺炎的分子生物学鉴定
• 4 小结
• 试验二 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA和TbpB基因的克隆、序列分析和原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶和其它试剂
• 1.3 溶液配制
• 1.3.1 琼脂糖凝胶电泳所用溶液
• 1.3.2 大肠杆菌感受态细胞制备及转化用溶液
• 1.3.3 质粒小量提取（Lysis Trtion法）用溶液
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 引物的设计与合成
• 1.5.1 ApxⅠA基因扩增引物的设计与合成
• 1.5.2 TbpB基因扩增引物的设计与合成
• 1.6 App基因组DNA的提取
• 1.7 ApxⅠA和TbpB基因的扩增
• 1.7.1 ApxⅠA基因的扩增
• 1.7.2 TbpB基因的扩增
• 1.8 克隆载体pMD18-T-ApxⅠA和pMD18-T-TbpB的构建
• 1.8.1 ApxⅠA和TbpB基因PCR产物的回收
• 1.8.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 1.8.3 ApxⅠA和TbpB基因与pMD18-T Vector的连接
• 1.8.4 ApxⅠA和TbpB基因与pMD18-T Vector的连接物的转化
• 1.8.5 ApxⅠA和TbpB基因重组质粒的小量制备
• 1.8.6 ApxⅠA和TbpB基因重组质粒的PCR鉴定
• 1.8.7 ApxⅠA和TbpB基因重组质粒的双酶切鉴定
• 1.9 表达载体pET32a（+）-ApxⅠA和pET32a（+）-TbpB的构建
• 1.9.1 ApxⅠA基因片段和载体pET32a（+）的酶切回收
• 1.9.2 TbpB基因片段和载体pET32a（+）的酶切回收
• 1.9.3 ApxⅠA和TbpB基因片段与表达载体pET32a（+）的连接和转化
• 1.9.4 重组质粒的初步筛选和提取
• 1.9.5 重组原核表达载体质粒PCR鉴定
• 1.9.6 重组原核表达载体质粒的双酶切鉴定
• 1.10 ApxⅠA和TbpB基因在pET32a（+）表达系统中的表达与鉴定
• 1.10.1 表达菌株大肠杆菌BL21感受态细胞的制备
• 1.10.2 pET32a（+）-ApxⅠA和pET32a（+）-TbpB重组表达质粒转化到BL21
• 1.10.3 ApxⅠA和TbpB蛋白表达
• 1.10.4 ApxⅠA和TbpB基因表达蛋白的鉴定
• 2 结果
• 2.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA和TbpB基因的扩增
• 2.2 重组质粒pMD18-T-ApxⅠA的PCR和酶切鉴定
• 2.3 重组质粒pMD18-T-Tbp B的PCR和酶切鉴定
• 2.4 重组质粒pMD18-T-ApxⅠA的测序鉴定
• 2.5 ApxⅠA基因核苷酸和蛋白质同源性分析
• 2.6 重组质粒pMD18-T-TbpB的测序测定
• 2.7 TbpB基因和蛋白质同源性分析
• 2.8 重组质粒pET32a（+）-ApxⅠA的PCR和酶切鉴定
• 2.9 重组质粒pET32a（+）-TbpB的PCR和酶切鉴定
• 2.10 ApxⅠA和TbpB基因在pET32a（+）表达系统中的表达
• 2.10.1 重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定
• 2.10.2 Western-blotting分析
• 3 讨论
• 3.1 ApxⅠA、TbpB基因的扩增和克隆
• 3.2 序列分析
• 3.3 关于pET32a（+）载体选择
• 3.4 关于pET32a（+）-ApxIA和pET32a（+）-TbpB的表达
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况