志贺氏菌多克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

论文摘要

志贺氏菌属细菌属于肠道致病菌,可引起临床上严重的腹泻。目前志贺氏菌的检测方法有:常规检测方法、分子生物学检测方法、毒素检测以及免疫学检测方法等。常规检测方法虽然准确性好,但所需时间长;分子生物学方法快速、灵敏、特异性强,且适用于不常见或新的病原微生物的检测,但成本较高,且要求较高的技术水平;VITEK（全自动细菌生化分析仪）、VIDAS（全自动免疫分析仪）等虽然快速准确、检测量大,但仪器费用颇高;免疫学中ELISA方法,具有操作简便、快速、灵敏的优点而广泛应用于致病菌的检测。本文通过对热灭活的抗原免疫新西兰大白兔,制备的抗血清,通过间接ELISA方法测得抗体效价,发现免疫家兔50d后抗体逐渐上升,最终抗体效价为1:51200,采用辛酸-硫酸铵方法纯化抗体得到纯度较高的IgG。通过对间接ELISA反应条件的系列摸索,确定了各组分的最适工作条件。试验结果表明,Costar公司生产的酶标板的变异系数为9.3%,达到ELISA的要求;最适封闭条件为5%脱脂牛乳,37℃,1h;抗体最适浓度为1.25μg/mL;抗体和HRP羊抗兔IgG的反应时间均为37℃,1h;间接ELISA方法底物在室温显色5min,志贺氏菌检测灵敏度为105～106cfu/mL。通过对Dot-ELISA系列反应条件的摸索,确定了各组分的最适工作条件。试验结果表明:最适封闭条件为5%脱脂牛乳,37℃,1h;抗体最适浓度为2.5μg/mL;抗体和HRP羊抗兔IgG的反应时间均为37℃,1h;底物在室温显色15min,Dot-ELISA检测志贺氏菌检测灵敏度为106cfu/mL。阻断试验和交叉试验表明抗体不与沙门氏菌、变形杆菌、单增李斯特菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌、芽孢杆菌反应,具有良好的特异性。本研究建立的检测方法,为志贺氏菌的检测提供了行之有效的技术手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 志贺氏菌概况
• 1.1.1 志贺氏菌的发现
• 1.1.2 志贺氏菌生物学特性
• 1.2 志贺氏菌的检测方法
• 1.2.1 常规检测技术
• 1.2.2 分子生物学方法
• 1.2.3 以免疫学方法建立的志贺氏菌快速检测技术
• 1.2.4 毒素检测
• 1.2.5 快速生化检测仪器法
• 1.2.6 化学鉴定法
• 1.3 本研究的意义
• 第二章 抗体的制备与纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株来源
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 ELISA溶液的配制
• 2.1.7 蛋白反应液
• 2.1.8 SDS-PAGE缓冲液的配制
• 2.1.9 动物饲养与处理
• 2.2 方法
• 2.2.1 抗体的制备
• 2.2.2 抗体纯化
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 抗体产生进程
• 2.3.2 间接ELISA测抗体效价
• 2.3.3 抗体纯度鉴定
• 2.3.4 抗体浓度测定
• 2.3.5 抗体纯化后效价
• 2.4 小结
• 第三章 间接ELISA条件的优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 抗体
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 ELISA试剂和溶液
• 3.2 方法
• 3.2.1 间接—ELISA最佳工作条件确定
• 3.2.2 特异性实验
• 3.2.3 志贺氏菌的检测限
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 间接—ELISA最佳工作条件确定
• 3.3.2 特异性试验
• 3.3.3 志贺氏菌检测限
• 3.4 小节
• 第四章 间接Dot-ELISA方法的建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 抗体
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 ELISA试剂和溶液
• 4.2 间接Dot-ELISA方法的建立
• 4.2.1 间接Dot-ELISA方法的操作程序
• 4.2.2 结果判定
• 4.2.3 特异性试验
• 4.2.4 志贺氏菌的检测限
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 间接Dot-ELISA条件确定
• 4.3.2 抗体特异性
• 4.3.3 Dot-ELISA检测志贺氏菌的检测限
• 4.4 小结
• 参考文献
• 致谢