论文摘要
背景:2003年Chambers和Mitsui分别用不同的研究战略同时克隆得到nanog,其对于胚胎干细胞（embryonic stem cell ,ESC）多能性的维持起作用。已有研究表明LIF—LIFR/gpl30一JAK—STAT3,Oct一3/4是已知的维持胚胎干细胞多能性的2条主要途径,nanog能够不依赖LIF/ Stat3独自维持胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）和ESC细胞的多能性,它是与STAT3和Oct4平行的另一条分子途径。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有干细胞持续增殖和多向分化的特性,应用上较少伦理上的争议,它在体内可向多种急性损伤后的组织迁移并定位,在局部微环境的调控下分化为不同的组织细胞,具有易通过血-脑屏障,少有免疫排斥反应等特点,是移植治疗的理想靶细胞,成为近年细胞移植研究热点。慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应,可向同一细胞引入两种不同的基因,或对同一细胞反复感染等优点,是基因治疗的良好载体。本课题设想通过慢病毒载体的介导,将nanog基因转移至MSCs中,检测其在MSCs中的表达,探讨nanog是否对MSCs的分化增殖产生影响,并为后续实验提供依据。目的:1.构建nanog基因重组慢病毒载体质粒及鉴定2. nanog基因修饰骨髓间充质干细胞3.检测nanog基因在骨髓间充质干细胞中的表达4.探讨nanog是否对MSCs的增殖产生影响方法:1.根据载体上的酶切位点,设计上下游引物,通过PCR方法扩增目的基因片段。2. PCR扩增nanog目的基因片段及PNL载体质粒分别用SalΙ限制性内切酶及BamHΙ限制性内切酶进行双酶切,后用T4 DNA连接酶将目的DNA片段与PNL载体质粒连接,构建PNL-Nanog-IRES2-EGFP重组质粒,后经转化,抗性筛选,挑选阳性克隆进行扩增,鉴定,测序。3.通过脂质体介导慢病毒三质粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP（或pNL-IRES2-EGFP,做为空载体对照）、pVSVG、pHELPER共转染293T细胞,收集病毒上清进行超速离心浓缩,测定病毒滴度,PCR检测病毒基因组中目的基因nanog的插入。4.通过密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法在体外提取、扩增培养小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,并经流式细胞学检测各代CD29、CD34、CD45的表达情况。5.将慢病毒液加入MSCs中,感染MSCs,荧光显微镜观察表达情况。6.通过细胞RT-PCR检测nanog的mRNA表达,Western blot检测nanog蛋白的表达情况。7.通过在培养基中加入bFGF,比较pNL-MSCs组和nanog-MSCs组细胞生长状况,并用MTT方法检测MSCs的增殖状况。结果:1.质粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP经双酶切后凝胶电泳鉴定正确,测序结果为918bp大小,与Genbank报道序列一致。2.重组的载体质粒（nanog组）或空载体质粒（pNL组）转染293T细胞后用荧光显微镜观察,nanog组和pNL组均可见大量绿色荧光。测得病毒滴度为6.0×107TU/mL。病毒基因组行PCR后,以凝胶电泳检测,可见918bp处明亮条带。3.原代贴壁培养的骨髓细胞中CD34、CD45有少量阳性表达,经过传代后呈阴性表达;CD29表达呈阳性,表达率随着细胞传代而逐渐升高,提示获取的细胞为MSCs。4.慢病毒感染MSCs后,荧光显微镜下观察,pNL-MSCs组和nanog-MSCs组均可检测到绿色荧光表达,未感染的MSCs未见荧光表达。5. nanog-MSCs组的RT-PCR,凝胶电泳检测,可见918bp处明亮条带,pNL-MSCs组阴性。6. nanog-MSCs组Western blot结果可见37KD左右的目的条带,pNL-MSCs组和MSCs组阴性。7.培养基中加入bFGF培养2代后,nanog-MSCs组细胞与pNL-MSCs组比较,在形态上无明显差别,MTT方法检测两组细胞增殖状况,通过统计学分析无明显统计学意义。结论:1.通过限制性内切酶酶切和基因重组的方法成功构建了慢病毒载体质粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP。2.通过脂质体转染包装生产了高滴度慢病毒颗粒,目的基因可插入病毒基因组中,病毒产量可满足感染MSCs的要求。3.慢病毒对MSCs有较高的感染率,目的基因可插入MSCs基因组中,并可成功转录和表达。4.目的基因nanog插入MSCs基因组中对MSCs细胞增殖影响有待进一步探讨。
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