荒漠藻胞外聚合物抗肿瘤机制的研究

论文摘要

研究表明,荒漠藻胞外聚合物（extracelluar polymeric substances,EPS）在其适应强辐射胁迫,温度胁迫和水分胁迫方面起着重要作用,同时在荒漠地区生物结皮形成中扮演着不可替代的生态学功能。然而,有关EPSs抗肿瘤方面的生物活性在国内外尚未见报道。本研究从EPSs对体外培养的人表皮癌细胞系（A431）存活率的影响,细胞的形态学变化,细胞DNA受损情况方面探索了EPSs的抗肿瘤活性;从细胞抗氧化系统失调,细胞凋亡相关基因表达改变等方面研究了EPSs抗肿瘤的可能机制。具体研究内容与结果如下:（1）采用MTT法检测EPSs对A431细胞存活力的影响,通过Bliss法计算5种藻胞外聚合物作用于A431细胞96h的半抑制浓度(InhibitoryConcentration,IC50)分别为:EPS-M（EPS-M.vaginatus）,2.75mg/mL;EPS-N（EPS-Nostoc sp.）,5.32mg/mL;EPS-D（EPS-D.olvaceus）,4.68mg/mL;EPS-P（EPS-P.tenue）,9.44mg/mL;EPS-S（EPS-S.javanicum）,4.25mg/mL。虽然五种藻的胞外聚合物对A431细胞都有较强的生长抑制作用,但不同来源的EPSs作用效果存在着一定的种属差异,这可能与不同藻的胞外聚合物的组成成分、糖链构象间差异有关。（2）采用HE染色,AO/EB染色和Giemsa染色3种方法观察细胞的形态学变化。实验结果表明形态学上出现了典型的细胞凋亡形态。HE染色从总体上观察了A431细胞的凋亡。AO/EB染色区分了凋亡细胞和坏死细胞,而Giemsa染色则清楚的显示核结构的变化。结果提示EPSs诱导了A431细胞凋亡。（3）采用彗星电泳法检测DNA受损情况,各EPSs实验组电泳的结果都出现明显的彗尾。利用CASP分析软件分析彗尾长度和彗星细胞所占的比例,各实验组与对照组相比,差异均为显著（p＜0.05）。其中以EPS-M和EPS-S的作用最为明显,彗星细胞率分别达到77.8%和76.2%。结果提示EPS造成了A431细胞内DNA不同程度的损伤。（4）采用化学比色法检测EPSs作用于A431细胞不同时间后,细胞内抗氧化系统酶类的活性（superoxide dismutase,SOD;glutathione peroxidases,GPX）,小分子抗氧化剂（reduced glutathione,GSH）以及脂质过氧化产物MDA（Malondialdehyde）含量的变化。结果显示,细胞内的SOD和GPX的活性均出现先升高后降低的变化趋势,GSH的含量也出现类似的变化趋势,MDA的含量则随作用时间的延长而逐渐增加。结果提示EPSs的作用破坏A431细胞内的抗氧化系统的平衡,将细胞内抗氧化酶类和小分子抗氧化剂消耗殆尽,使细胞无法再进行自我防御,进而导致细胞凋亡的启动。（5）采用蛋白质印迹（Western Blotting）检测了Caspase-3和Caspase-9的表达。研究结果显示,EPSs的作用上调了Caspase-3和Caspase-9的表达,使Pro-caspase-3被剪接而激活,并且这种激活作用呈现出剂量依赖型效应,但各实验组间也有所不同,其中EPS-M和EPS-D实验组作用效果较为明显。Caspase-9表达的上调,在EPS-M和EPS-D实验组中不随着作用浓度的增大而上升,而是在2mg/mL时上调作用最为明显,而后随作用浓度的增加逐渐减弱,而EPS-N,EPS-P,EPS-S实验组的Caspase-9表达的上调则出现与剂量成正比关系。正是由于caspase-9酶原的激活导致了凋亡执行因子caspase-3酶原的激活,进而激活了细胞凋亡的线粒体途径。（6）采用免疫组织化学法（immunohistochemical staining,IHC）检测了Caspase-3,Bax和Bcl-2的表达。EPSs的作用上调Caspase-3和Bax的表达而下调Bcl-2的表达,EPS-M对Caspase-3表达上调作用最为明显,阳性率达到81.2±5.16%;EPS-S对Bax表达上调作用最为显著,阳性率达到86.5±13.05%;而在抑制Bcl-2过表达中,EPS-S的作用最为明显,阳性率从72.6±6.45%下降到6.5±1.67%,这些结果与对照组相比均有显著性差异（p＜0.05）。实验结果提示EPSs的作用改变了凋亡相关基因Caspase-3,Bcl-2和Bax的表达,启动了细胞凋亡的线粒体途径。总上所述,本研究从A431细胞存活率,形态学变化,DNA受损情况方面充分说明了EPSs的抗肿瘤活性。利用蛋白质印迹技术和免疫组织化学染色法检测了凋亡相关基因Caspase-9,Caspase-3,Bcl-2和Bax的表达变化,证明诱导细胞凋亡是EPSs抗肿瘤机制之一,并且激活细胞凋亡的线粒体途径。此外,EPSs的作用引起细胞内氧化/抗氧化系统失调是其诱导细胞凋亡另一条可能途径。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 前言
• 第一节 藻多糖的研究进展
• 1 藻多糖的生物活性的研究进展
• 1.1 抗肿瘤作用
• 1.2 对免疫功能的影响
• 1.3 抗病毒作用
• 1.4 抗辐射作用
• 1.5 抗氧化作用
• 2 藻多糖的理化性质及生态学功能的研究进展
• 2.1 藻多糖的组成成分及理化性质
• 2.2 荒漠藻胞外聚合物的生态学功能的研究
• 第二节 多糖抗肿瘤机制的研究进展
• 1 对肿瘤细胞的直接作用
• 1.1 改变细胞膜组分
• 1.2 影响信号转导
• 1.3 诱导凋亡和抑制诱导分化
• 1.4 抑制核酸和蛋白质合成
• 1.5 对癌基因的影响
• 2 增强机体免疫功能,提高机体的抗肿瘤作用
• 2.1 激活巨噬细胞
• 2.2 活化淋巴细胞
• 2.3 促进细胞因子分泌
• 2.4 活化补体
• 3 抗氧化、清除自由基作用
• 4 抑制肿瘤组织血管生成
• 5 多糖的抗肿瘤活性与其结构的关系
• 第三节 细胞凋亡机理的研究进展
• 1 线粒体依赖性凋亡途径
• 2 死亡分子及其受体介导的凋亡途径
• 3 氧化胁迫与细胞凋亡
• 第二章 EPSS诱导A431细胞凋亡的研究
• 前言
• 第一节 MTT法检测EPSs对A431细胞的生长抑制作用
• 1 材料与方法
• 1.1 EPSs的制备
• 1.2 人表皮癌细胞（A431）的培养
• 1.3 MTT法检测A431的存活率
• 2.结果与讨论
• 第二节 EPSs诱导A431细胞凋亡的形态学变化
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 HE染色观察A431细胞形态学变化
• 1.2 AO/EB染色观察细胞形态学变化
• 1.3 Giemsa染色观察细胞核结构的变化
• 2 结果与讨论
• 第三节 单细胞凝胶电泳法检测细胞DNA损伤情况
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果与讨论
• 第三章 EPSS诱导A431细胞凋亡机制的研究
• 前言
• 第一节 氧化/抗氧化系统失调与细胞凋亡的研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 GSH的测定
• 1.2 MDA的测定
• 1.3 SOD酶活性的测定
• 1.4.GPX的测定
• 1.5 数据统计分析
• 2.结果与讨论
• 2.1 EPSs对A431细胞GSH含量的影响
• 2.2 EPSs对A431细胞SOD活性的影响
• 2.3 EPSs对A431细胞GPX活性的影响
• 2.4 EPSs对A431细胞MDA含量的影响
• 第二节 EPSs诱导A431细胞凋亡的线粒体途径的研究
• 前言
• 1 蛋白质免疫印迹分析（Western Blotting）
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果与讨论
• 2 免疫组织化学（HIC）分析细胞凋亡相关基因的表达
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与讨论
• 第四章 小结与展望
• 参考文献
• 在学期间论文发表情况
• 致谢