白腐菌降解菌草及其降解酶系的特性研究

论文摘要

木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成,是自然界中广泛存在可再生的数量巨大的生物质资源,但目前仍未被充分利用,其主要障碍在于木质素难于降解和转化;白腐菌是目前发现的对木质素降解最有潜力的微生物之一。黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）作为木质素生物降解模式种,一直是被广泛研究的对象,但它的木质素降解酶活性并不令人满意,如常规条件不产生漆酶,而漆酶却是木质素酶系的重要成员。因此,选育高产木质素降解酶菌株、了解其降解机制和木质素降解酶分离纯化是本研究木质素降解的主要研究内容。本文以探索高效降解木质素为指标,通过测定14株菌草食用菌在愈创木酚、苯胺兰和鞣酸培养基的培养上的生长状况和酶活分泌的能力,得到8株菌株都能产生阳性反应;以木质素和综纤维素失重的比值（SF指数）为指标,对这几株进行了复筛,侧耳WP1和平菇10969选择性指数分别为2.31和1.86。与黄胞原毛平革菌P.chrysosporium RP78和P.chrysosporium BKM-F-1767两株模式菌相比,菌株具有好的生长优势、强的酶系分泌能力和降解的优势。固体发酵培养平菇10969,菌草培养白腐菌过程中,只检测到一种木质素过氧化物酶—漆酶（laccase）,酶活达1807U/mL,而随着时间的延长,Lac酶活逐渐降低,而未检测到LiP和MnP,傅里叶红外光谱分析（FTIR）基质表面基团表明化;发酵液经过硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析纯化倍数达到3.67,得到酶蛋白的分子量约为40kDa,研究了其酶学性质。同时克隆了纤维素酶基因（egl2）和半纤维素酶基因（xyn2）,表达蛋白并测定酶活,将粗酶液处理不同的纤维材料,结果表明,其还原糖的产量:综纤维素（酸解）＞菌草（白腐菌处理）＞未处理的菌草。本文进行几种菌草食用菌对菌草木质素降解菌的筛选、漆酶的分离纯化和纤维素酶处理纤维材料方面的研究。白腐菌的利用,使得草质资源的充分利用,同时对污染物的降解以及燃料乙醇等有着重要的应用意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 生物质能源与菌草
• 1.1.1 生物质能
• 1.1.2 我国生物质能资源
• 1.2 白腐菌及木质纤维素的降解
• 1.2.1 白腐菌对木质素的降解
• 1.2.2 白腐菌对纤维素的降解
• 1.2.3 白腐菌对半纤维素的降解
• 1.3 白腐菌木素降解酶的基本特性与作用机理
• 1.3.1 木素过氧化物酶（LiP）
• 1.3.2 锰过氧化物酶（MnP）
• 1.3.3 漆酶（Lac）
• 1.4 课题思路提出与设计
• 2 高效降解菌草的食用菌筛选
• 2.1 试验材料与方法
• 2.1.1 试验菌株
• 2.1.2 菌草粉
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 试剂与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株筛选
• 2.2.2 变色圈实验
• 2.2.3 木质素降解试验
• 2.2.4 降解率测定及选择性指数（SF）的计算
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 选择性筛选
• 2.3.2 菌落直径和变色圈直径的比值测定（d1/d2）
• 2.3.3 苯胺兰固体培养基和鞣酸固体培养基的筛选
• 2.3.4 木质素降解
• 2.3.5 SF指数计算
• 2.3.6 相关性检验
• 2.4 小结与讨论
• 3 白腐菌对菌草的降解及其漆酶的分离纯化
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 试验菌株
• 3.1.2 菌草粉
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 试剂与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 培养与培养方法
• 3.2.2 酶活测定方法
• 3.2.3 傅立叶红外光谱分析（FTIR）
• 3.2.4 漆酶发酵液的纯化
• 3.2.5 蛋白含量的测定
• 3.2.6 SDS-PAGE和Native PAGE
• 3.2.7 漆酶酶学性质研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 木素过氧化物酶的动态变化
• 3.3.2 红外光谱检测表面功能基团变化
• 3.3.3 硫酸铵分级沉淀
• 3.3.4 蛋白的凝胶过滤层析
• 3.3.5 SDS-PAGE鉴定酶的纯度及测定酶的分子量
• 3.3.6 Native PAGE分析
• 3.3.7 漆酶的酶活性质研究
• 3.4 小结与讨论
• 4 纤维素酶（eg/2）和半纤维素酶（xyn2）基因的克隆表达
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 菌草粉
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 试剂与仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 酶活测定方法
• 4.2.2 目的基因的PCR
• 4.2.3 目的基因的TA克隆
• 2法）'>4.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 4.2.5 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
• 4.2.6 小量提取重组质粒
• 4.2.7 表达载体的构建
• 4.2.8 重组质粒验证
• 4.2.9 大肠杆菌BL21感受态细胞及IPTG诱导
• 4.2.10 蛋白质的纯化、复性
• 4.2.11 SDS-PAGE及酶活测定
• 4.2.12 蛋白的表达与处理综纤维素和菌草
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 克隆载体的构建
• 4.3.2 表达载体的构建
• 4.3.3 蛋白的表达及酶谱分析
• 4.3.4 综纤维素的降解
• 4.4 小结与讨论
• 5 总结与展望
• 5.1 主要研究结果
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢