蛋白酶体降解SCA3疾病相关蛋白ataxin-3的研究

论文摘要

脊髓小脑共济失调三型（SCA3）即马查多-约瑟夫病（MJD）,是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病。在各种脊髓小脑共济失调疾病中,SCA3是最常见的亚型.SCA3的主要症状是小脑变性,锥体和外锥体病变,进行性眼外肌麻痹和面部抽搐等。国际报道SCA3病人的平均发病年龄为37.4±14.1岁,国内基因诊断的SCA-3/MJD患者平均发病年龄为33.9±9.5岁。它的发病主要是由于致病基因MJD1产物ataxin-3的C末端发生多聚谷氨酰胺数目的异常扩增引起的.Ataxin-3在人体内广泛存在,与其它多聚谷氨酰胺疾病一样,当polyQ扩增时,蛋白会形成错误折叠。SCA3的显著特征是在脑组织细胞中形成大量泛素化的聚集,这些由多聚谷氨酰胺蛋白异常折叠所引起的聚集常常和分子伴侣,转录因子以及蛋白酶体共定位在一起,这些现象提示SCA3的发病机理可能与改变或损伤上述蛋白功能有关。泛素蛋白酶体通路（UPP）是细胞内重要的降解途径,短寿命蛋白,异常折叠蛋白或者损伤多肽等都通过UPP降解。底物蛋白先是经过泛素激活酶（E1）,泛素结合酶（E2）,泛素连接酶（E3）等多种酶的多步反应后被标记上泛素链,然后被转运蛋白带到蛋白酶体降解。19S蛋白酶体是催化亚基,是由多个亚单位组成,其中有六个具有ATP酶活性的蛋白。这六个ATP酶具有一定的底物特异性,通过单个的突变可以找到各自不同的特异底物。P45是其中的一个ATP酶,它可以结合Sp1和vitamin D受体并促进后两者的降解。Ataxin-3包含有2个或3个UIM,通过UIM区域可以结合泛素化底物并通过ataxin-3的Josephin domain来行使去泛素酶的功能.Ataxin-3还可以结合HHR23和VCP,它们具有将泛素化底物运送到蛋白酶体的功能,这提示ataxin-3和蛋白酶体有着紧密的联系。另外研究表明ataxin-3是泛素蛋白酶体底物,但是明确的降解机制还不清楚。我们的实验显示ataxin-3与蛋白酶体有直接的联系。在体外和细胞内野生型（正常长度polyQ）和突变（异常扩增polyQ）ataxin-3与19S蛋白酶体上具有ATP酶活性的亚基p45直接结合。细胞内共转染实验表明p45可以调控的ataxin-3的降解,体外降解系统中我们得到同样的结论。这种调控作用可以被蛋白酶体抑制剂MG-132所阻断。在N2a或者HEK293细胞系中,过表达的p45可以显著地促进ataxin-3的降解,而另外两种神经退行性疾病相关蛋白,SOD1和alDhasynuclein却不被p45调控,这说明p45对ataxin-3的调控是特异的。另外p45的ATP酶活性对于它的功能也十分重要,实验表明丧失ATP酶活性的p45不再促进ataxin-3的降解.我们确认了ataxin-3与p45结合的位点在N端,另一组实验则证明p45对ataxin-3的调控作用依赖于ataxin-3的泛素结合区（UIM）,但是仅有UIM区又不足以造成p45对它的降解调控。p45与蛋白酶体上其他几个具有ATP酶活性的蛋白同源性很高,我们发现只有p45对ataxin-3具有调节降解的作用,这也说明了此促进降解的作用是特异的。综上我们得出结论:蛋白酶体上具有ATP酶活性的蛋白p45可以特异性的促进ataxin-3通过蛋白酶降解,这种作用是通过与ataxin-3 N端的直接结合并且依赖于UIM功能区域的。这一发现可能为我们更好的了解SCA3的发病机制,寻求治疗SCA3的方法提供一些帮助。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 绪论
• 1.1 多聚谷氨酰胺疾病和脊髓小脑共济失调三型（SCA3）
• 1.1.1 多聚谷氨酰胺疾病简介
• 1.1.2 脊髓小脑共济失调三型（SCA3）
• 1.1.3 神经退行性疾病中的蛋白聚集
• 1.2 泛素蛋白酶体系统
• 1.2.1 泛素和蛋白酶体简介
• 1.2.2 泛素蛋白酶体在神经退行性疾病中的作用
• 1.3 MJD1基因和ataxin-3蛋白
• 1.3.1 C端CAG重复序列
• 1.3.2 UIM domain
• 1.3.3 N端的Josephin结构域
• 1.3.4 核定位序列
• 1.3.5 多聚谷氨酰胺周围的序列
• 1.3.6 Ataxin-3的去泛素化功能
• 1.3.7 Ataxin-3的其它调控功能
• 1.4 对SCA3发病的重要通路
• 1.4.1 Caspase切割与凋亡对SCA3的作用
• 1.4.2 Ataxin-3是自噬的底物
• 1.4.3 蛋白酶体与ataxin-3的关系
• 1.5 多聚谷氨酰胺疾病的治疗展望
• 1.6 蛋白酶体上具有ATP酶活性蛋白介导底物降解
• 1.7 参考文献
• 第二章 材料与方法
• 2.1 细胞Toatl RNA的提取及逆转录cDNA
• 2.2 聚合酶链式反应（polymerase Chain Reaetion,PCR）
• 2.3 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳
• 2.4 从琼脂糖凝胶上回收DNA片段（taKaRa Agrose Gel DNA PuriifcationKit）
• 2.5 质粒DNA或DNA片段的限制内切性酶酶切
• 2.6 DNA片段的连接反应（TaKaRa MutanBESTKit）
• 2.7 大肠杆菌化学感受态细胞的制备
• 2.8 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.9 大肠杆菌质粒DNA小量抽提
• 2.10 大肠杆菌质粒DNA大量抽提
• 2.11 基于PCR的DNA定点突变（TaKaRa MutanBESTKit）
• 2.12 本论文中所用质粒载体的构建
• 2.13 大肠杆菌中蛋白质诱导表达
• 2.14 蛋白质的SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS-APGE）
• 2.15 Gst-Tag融合蛋白的小量纯化
• 2.16 His-tah融合蛋白的小量纯化
• 2.17 MBP-tag融合蛋白的小量纯化
• 2.18 经纯化所得到的蛋白溶液的脱盐与浓缩
• 2.19 体外降解实验
• 2.20 GST Pull-down
• 2.21 Western Blot
• 2.22 细胞培养
• 2.23 细胞转染（脂质体转染法）
• 2.24 稳定表达目的蛋白的细胞株的筛选
• 2.25 细胞的裂解
• 2.26 放线菌酮（CHX）追踪实验
• 2.27 免疫共沉淀（Co-immunocipitation,Co-IP）
• 2.28 免疫细胞化学染色（以53mm细胞培养皿为例）
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 p45与多聚谷氨酰胺正常和异常扩增的ataxin-3有体外结合
• 3.2 p45促进多聚谷氨酰胺正常和异常扩增的ataxin-3的降解
• 3.3 p45在体外系统中能促进ataxin-3的降解
• 3.4 免疫共沉淀实验中p45与ataxin-3的结合
• 3.5 p45特异地调控ataxin-3的降解
• 3.6 p45的调节作用不完全依赖于ataxin-3的UIM结构域
• 3.7 Ataxin-3的N端与p45结合并且在p45的调控作用中是必要的
• 3.8 MSS1,p48,p56等其他19S蛋白酶体上具有ATP酶活性的亚基不能促进ataxin-3的降解
• 3.9 实验结果讨论
• 3.10 参考文献
• 3.11 总结与展望
• 3.11.1 总结
• 3.11.2 展望
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文与参加的学术会议