异三聚体G蛋白在生长素介导的拟南芥侧根发育中的作用机理研究

论文摘要

根系是植物体的重要组成部分,主要执行着吸收土壤养分和水分的功能。侧根的发育及形态与根系建成密切相关,生长素对侧根的发育具有重要的调节作用。有研究表明,异三聚体G蛋白在生长素介导的拟南芥侧根发育过程中发挥作用,但是其作用机理尚不明晰。本文以拟南芥异三聚体G蛋白相关亚基突变体及过表达的转基因植株与悬浮培养细胞系为材料,应用植物解剖学、植物生理学、分子遗传学等研究手段,探讨了异三聚体G蛋白在生长素介导侧根发育中的作用机理。研究结果表明:1. G蛋白相关亚基突变显著影响根系发育表型。agb1-2及gpa1agb1幼苗的侧根发生数均极显著多于野生型（Col）,主根长度也显著长于Col。gpa1-3与Col间主根长度无显著性差异,但是gpa1-3幼苗的侧根发生数显著少于Col。2. G蛋白突变体的侧根发生依赖于生长素途径的调节。抑制生长素极性运输条件下,外源生长素可显著增加突变体及野生型的侧根发生数。但各基因型对生长素诱导侧根发生的敏感性存在差异,与Col相比,gpa1-3侧根发生对生长素低敏感,agb1-2及gpa1agb1对生长素超敏感。3.对种子萌发后2-4d内各基因型侧根原基发育时期统计结果表明,萌发后2d,各基因型侧根原基开始发生,gpa1-3与agb1-2的侧根原基数差异不明显,但均显著高于Col。萌发后4d,当茎端生长素开始向根部运输时,gpa1-3幼苗的侧根及侧根原基总数与Col类似,但是显著低于agb1-2和gpa1agb1。对侧根原基分布时期观察表明,gpa1-3的侧根及侧根原基约70%处于侧根发生的第3-5期,而agb1-2和gpa1agb1的侧根原基主要集中于第5-7期（agb1-2,55%;gpa1agb1,72%）,Col的侧根原基在侧根发育的各个阶段均匀分布。4.种子萌发4d时去除根茎交界处以上部分处理显著抑制各基因型的侧根发生,且各基因型间侧根发生数无显著差异,说明各基因型的侧根发生均依赖于地上部茎端合成的生长素。侧根发生早期（萌发后4d）去根尖处理促进了各基因型的侧根发生,但对agb1-2侧根发生影响较小,侧根发生数的增加显著低于Col。种子萌发后7d对幼苗去根尖处理的效应则相反,gpa1-3侧根发生数的增加显著低于Col。根据影响侧根发生的根部生长素运输特征分析,根部生长素的向基运输是影响G蛋白突变体侧根发生差异的主要因素。5.对GPA1和AGB1过表达转基因幼苗G蛋白亚基定位和侧根发育特征的研究结果表明,GPA1主要定位在根尖顶端及中柱部位,而AGB1在整个根部均有分布。GPA1过表达植株的侧根发生数目较野生型显著增加,AGB1过表达植株的侧根发生数与野生型相比无显著性差异。结合G蛋白突变体根系发育特征,根据G蛋白信号转导模式,推测AGB1在侧根发育过程中具有负调节作用。对种子萌发4d内过表达株系及野生型的侧根发育时期分布规律分析表明,在萌发第4d时AGB1过表达幼苗的侧根原基主要分布于第3-4期,GPA1过表达幼苗的侧根原基总数高于Col野生型,其增加的侧根原基主要集中在第3-5期,说明GPA1过表达有利于促进侧根原基的早期形成及分裂过程。6.不同基因型悬浮培养细胞对2,4-D和NAA的响应存在显著的差异。用2μM 2,4-D/NAA处理悬浮培养细胞系,agb1-2和GPA1过表达悬浮细胞对2,4-D促进的细胞分裂不敏感,对NAA诱导的细胞伸长过程超敏感。RT-PCR结果表明,在无外源生长素处理条件下,agb1-2悬浮细胞中细胞分裂周期素基因AtCYCD4;1的表达量相对较高。NAA处理促进了agb1-2和GPA1过表达悬浮细胞中与细胞伸长相关的ABP1的表达。根据2,4-D和NAA进出细胞机制的不同,可以推测AGB1突变体及GPA1过表达细胞系具有较强的生长素极性输出能力。7.对不同基因型的根系向重性反应研究表明:突变体agb1-2和过表达GPA1植株对向重性刺激的反应显著强于Col和gpa1-3,而过表达AGB1植株的向重性反应显著低于Col。8. Real-time PCR研究结果表明,agb1-2及GPA1过表达植株根部生长素极性输出载体PIN1的表达量显著增加。根据以上研究结果,认为G蛋白突变体的侧根发生差异是由于影响了根部生长素的向基运输途径,AGB1对这一过程具有负调节作用。AGB1突变促进了根系中生长素极性输出载体PIN1转录水平的表达,从而负调节根系中生长素的向基极性输出途径,促进侧根大量发生。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文对照词
• 第一章 文献综述
• 1.G 蛋白与植物的生长发育
• 1.1 G 蛋白概述
• 1.1.1 G 蛋白的组成及三维结构
• 1.1.2 G 蛋白的生物学定位
• 1.1.3 G-蛋白的信号转导通路
• 1.2 植物 G-蛋白功能的研究进展
• 1.2.1 G 蛋白在脱落酸和生长素信号转导途径中的作用
• 1.2.1.1 G 蛋白在脱落酸（Abscisic acid, ABA）信号转导途径中的作用
• 1.2.1.2 G 蛋白在生长素（Auxin）信号转导中的作用
• 1.2.2 G 蛋白在光信号转导途径中的作用
• 1.2.3 G 蛋白在抗真菌防御机制中的作用
• 1.2.4 G 蛋白在调控细胞分裂周期进程中的作用
• 1.2.5 G 蛋白在植物的生长发育过程中的作用
• 1.2.5.1 G 蛋白与植物种子的萌发
• 1.2.5.2 G 蛋白在根系生长发育中的作用
• 1.2.5.3 G 蛋白在茎叶生长发育中的作用
• 1.2.5.4 G 蛋白在植物生殖生长中的作用
• 2 生长素的极性运输与信号转导
• 2.1 植物体内的生长素极性运输
• 2.1.1 AUX 蛋白与生长素的极性运输
• 2.1.2 PIN 蛋白与生长素的极性运输
• 2.1.3 影响生长素极性运输的其它因子
• 2.2 植物体内的生长素信号转导
• 2.2.1 生长素受体
• 2.2.2 ARFs 蛋白和Aux/IAA 蛋白
• TIR1泛素途径'>2.3.3 SCF^TIR1泛素途径
• 3. 侧根发育研究进展
• 3.1 侧根发育过程
• 3.1.1 侧根原基的发生
• 3.1.2 侧根的发生位置
• 3.2 影响侧根发育的因素
• 3.2.1 营养元素对侧根发育的影响
• 3.2.2 激素对侧根发育的调节
• 3.2.2.1 生长素与侧根发育
• 3.2.2.2 其它激素与侧根发育
• 4. 本研究的目的及研究内容
• 参考文献
• 第二章 G 蛋白对生长素介导的拟南芥侧根发育的影响
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料及培养条件
• 2.2 突变体的鉴定
• 2.3 侧根原基发生的组织学观察
• 2.4 根冠比的测定
• 2.5 生长素处理及根系生长发育指标的测定
• 2.5.1 生长素及生长素运输抑制剂处理
• 2.5.2 无菌苗的根系生长发育指标测定
• 2.6 去茎尖、根尖实验
• 2.6.1 去茎尖处理
• 2.6.2 去根尖处理
• 2.7 根系生长素含量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 拟南芥 G 蛋白 α 亚基和 β 亚基缺失突变体的 RT-PCR 鉴定
• 3.2 G 蛋白突变体的根系发育特征
• 3.3 生长素及生长素运输抑制剂对拟南芥G 蛋白突变体根系发育的影响
• 3.3.1 生长素及生长素运输抑制剂对主根伸长的影响
• 3.3.2 生长素及生长素运输抑制剂对侧根发育的影响
• 3.4 不同基因型侧根原基发生过程的形态学特征分析
• 3.4.1 不同基因型幼苗的侧根发生过程分析
• 3.4.2 不同基因型的侧根原基发育时期分布特征比较
• 3.5 根尖、茎尖端的生长素极性运输对侧根发生的影响
• 3.5.1 茎端生长素的向顶运输对侧根发生的影响
• 3.5.2 根端生长素的向基运输对侧根发生的影响
• 3.6 不同基因型拟南芥根部生长素含量比较
• 4 讨论
• 4.1 茎端合成的生长素是促进 agb1-2 侧根大量发生的主要因素
• 4.2 根部生长素的向基运输是影响 G-蛋白突变体侧根发生差异的主要原因
• 4.3 GPA1 突变影响主根伸长生长对生长素的敏感性
• 参考文献
• 第三章 G-蛋白过表达植株的根系发育特征
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 菌株、载体及生化试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 拟南芥 GPA1、AGB1 基因的克隆与转化
• 2.3.2 转基因拟南芥种子的抗性筛选及鉴定
• 2.3.3 转基因植株中融合蛋白的组织水平定位
• 2.3.4 转基因植株中 GPA1/AGB1 基因的半定量 RT-PCR 分析
• 2.3.5 转基因植株侧根原基的观察与计数
• 2.3.6 转基因植株根系生长发育指标的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 转基因植株的获得
• 3.1.1 GPA1 基因和 AGB1 基因全长 cDNA 序列的获得
• 3.1.2 GPA1 和 AGB1 基因的 TOPO 克隆与鉴定
• 3.1.3 农杆菌介导转化拟南芥植株
• 3.1.4 转基因植株的筛选
• 3.2 转基因植株根部的 GPA1/AGB1-GFP 融合蛋白的表达定位
• 3.2.1 转基因植株根尖部位的 GFP 融合蛋白定位
• 3.2.2 转基因植株幼根成熟区中的 GFP 定位
• 3.2.3 GPA1/AGB1-GFP 在新形成侧根中的表达定位
• 3.3 转基因植株的叶片及根系表型特征
• 3.4 转基因植株的根系发育特征
• 3.4.1 转基因植株的根系发育
• 3.4.2 生长素及生长素运输抑制剂对转基因植株侧根发育的影响
• 4 讨论
• 4.1 AGB1 负调节拟南芥侧根发育过程
• 4.2 AGB1 通过抑制生长素的极性运输途径负调节侧根发育
• 参考文献
• 第四章 G 蛋白在拟南芥悬浮细胞分裂和伸长中的作用
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 悬浮培养细胞系的建立
• 2.2 悬浮细胞研究方法
• 2.2.1 细胞处理
• 2.2.2 鲜重的称量
• 2.2.3 显微观察
• 2.2.4 细胞分裂指数的荧光观察
• 2.3 悬浮细胞的Western-blot 分析
• 2.3.1 膜蛋白的提取
• 2.3.2 蛋白质浓度测定及SDS-PAGE
• 2.3.3 Western Blotting
• 2.4 过表达悬浮细胞系的构建
• 2.4.1 质粒构建
• 2.4.2 农杆菌的转化培养
• 2.4.3 农杆菌介导的细胞转化
• 2.4.4 转化细胞的GFP-PCR 鉴定
• 2.5 悬浮细胞中相关基因的半定量RT-PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 2,4-D 和 NAA 在拟南芥 Col 悬浮细胞中的作用
• 3.1.1 2,4-D 和 NAA 对拟南芥悬浮细胞生长发育的影响
• 3.1.2 2,4-D 和 NAA 对 Col 悬浮细胞分裂的影响
• 3.1.3 2,4-D 和 NAA 对 Col 悬浮细胞伸长的影响
• 3.2 2,4-D 和 NAA 处理 Col 细胞中 GPA1 的表达量变化
• 3.3 过表达细胞系的构建及鉴定
• 3.4 过表达悬浮细胞系中融合蛋白的荧光定位
• 3.5 突变体、野生型、过表达悬浮细胞的形态特征
• 3.6 不同基因型细胞对2,4-D 和NAA 处理的响应分析
• 3.6.1 不同基因型细胞对 NAA 诱导伸胞伸长的响应
• 3.6.2 不同基因型细胞对 2,4-D 诱导的细胞分裂的响应
• 4 讨论
• 4.1 AGB1的突变促进了悬浮细胞中NAA的极性输出过程
• 4.2 GPA1对细胞分裂过程具有促进作用
• 参考文献
• 第五章 G 蛋白在生长素调节侧根发育过程中的作用机理
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 种子的无菌处理与萌发
• 2.3 生长素处理设置
• 2.4 根系生长发育指标的测定
• 2.5 根尖的重力刺激响应
• 2.6 Real-time PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 G 蛋白突变体及过表达植株的根系发育对 2,4-D 和 NAA 处理的响应
• 3.2 不同基因型的根尖向重性反应
• 3.3 AGB1负调节生长素介导侧根发育过程的分子机制探讨
• 3.3.1 生长素极性输出蛋白基因 PIN1 在不同基因型根系中 mRNA 水平的表达
• 3.3.2 周期素基因AtCYCD4;1在不同基因型根系中mRNA水平的表达
• 4 讨论
• 参考文献
• 第六章 结论与展望
• 1. 结论
• 2. 展望
• 附录
• 附录一 G-蛋白对拟南芥其它生长发育过程的调节
• 附录二
• 致谢
• 攻读学位期间发表的主要学术论文目录