论文摘要
人类的食管下括约肌（lower esophageal sphincter,LES）位于食管下端和胃的连接处,与大多数哺乳动物不同的是LES由大弯侧的套锁纤维（sling fibers）和小弯侧的钩状纤维（clasp fibers）构成。这两种平滑肌细胞形成一长约13cm的高压带,正常人静息时LES压力为1030mmHg,比胃内压高约510mmHg,发挥着生理括约肌的作用。正常情况下,LES处于持续的收缩状态,从而限制胃内容物反流入食管。但在进食或发生喛气、呕吐时,LES会适时松弛允许营养物质进入胃和胃内气体或内容物呕出。因此,当LES的功能状态和（或）结构发生异常变化时,则会引发多种食管疾病,如胃食管反流病、贲门失弛症等等。LES的功能调节机制非常复杂,包括神经系统、体液因素和肌源性因素。生理状态下,神经或内分泌细胞分泌的脑肠肽可以作为神经递质、神经调质及激素对LES的收缩和舒张进行调节,但无论调节发生在哪一水平,脑肠肽最终都要同LES表面的受体结合,激活受体后一系列信号转导机制,引发LES的收缩与舒张。以往的研究大多集中在脑肠肽通过中枢、外周及肠神经系统对胃肠运动进行调节,而对游离的单个套索纤维细胞和钩状纤维细胞运动规律研究较少。因此,有必要在细胞水平进一步研究LES套锁纤维和钩状纤维的受体及受体后信号转导机制,以便阐明LES运动的调节机制。脑肠肽要通过质膜上存在的肌醇脂质系统和环核苷酸系统将胞外信号转导入细胞内,从而引发LES发生收缩或舒张,即脑肠肽与细胞表面受体结合并使之活化,促使三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate, GTP）与不同的鸟苷酸结合蛋白（GTP-binding protein, G protein）结合并使之活化,使效应酶活化或抑制,进而引发不同的调控途径来调节LES的收缩或舒张。G蛋白在细胞跨膜信息传递过程中发挥着“桥梁”作用,所以阐明与脑肠肽受体偶联的G蛋白的类型对深入研究导致LES收缩或舒张的受体后信号转导通路具有重要意义。胃动素和胃泌素是人体内重要的兴奋性脑肠肽,对促进胃肠运动发挥重要作用。但是,关于胃动素和胃泌素与套锁纤维和钩状纤维特异性受体耦联的G蛋白信号转导通路研究较少。促胰液素是一种抑制性脑肠肽,可导致胃肠平滑肌舒张,使胃排空延迟。国内外有关促胰液素与LES功能的关系及信号转导途径研究较少,且大部分局限在动物水平,少数关于人LES的研究也停留在大体标本水平,同时在细胞水平对套锁纤维细胞和钩状纤维细胞与脑肠肽耦联的G蛋白及信号转导通路的研究比较少。因此本实验选用具有代表性的兴奋性脑肠肽（胃动素、胃泌素）和抑制性脑肠肽（促胰液素）应用于单个的套锁纤维和钩状纤维,研究脑肠肽对套锁纤维和钩状纤维作用的受体、G蛋白类型和受体后信号转导通路,期望在细胞水平进一步阐明兴奋性脑肠肽和抑制性脑肠肽的信号转导机制,进而深入认识LES的调节机制,这对于认识食管运动障碍性疾病具有重要意义。本研究用人LES游离的套锁纤维和钩状纤维,应用兴奋性脑肠肽（胃动素、胃泌素）和抑制性脑肠肽（促胰液素）,观察:（l）LES套锁纤维和钩状纤维的反应;（2）与脑肠肽受体耦联的G蛋白的类型;（3）兴奋性脑肠肽与肌醇脂质信号系统间的关系;抑制性脑肠肽与环核苷酸信号系统间的关系。通过上述研究在细胞水平深入了解脑肠肽干预下LES细胞内信号物质的变化规律,从而揭示脑肠肽对LES作用的本质。本实验主要分三个部分:第一部分胃动素对LES套索纤维和钩状纤维的调节作用及其信号转导通路目的:胃动素是一种由22个氨基酸组成的兴奋性脑肠肽,是启动消化间期胃肠移行性复合运动（migrating motor complex, MMO）的重要激素。本文主要讨论胃动素受体在人LES套锁纤维和钩状纤维中的表达规律,及胃动素引起套锁纤维细胞和钩状纤维细胞收缩规律及信号转导通路。方法:选取2009年5月至2010年10月期间因食管中段癌于河北医科大学第四附属医院行手术治疗患者5例,术中分别收集套索纤维和钩状纤维。（1）制备游离的套锁纤维和钩状纤维细胞悬液,不同浓度胃动素溶液(10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-12mol/L)作用于套锁纤维和钩状纤维引起收缩反应,随后应用2.5%的戊二醛终止反应,并记录套锁纤维和钩状纤维的长度变化。应用GraphPad Prism5.0软件对数据进行非线性回归分析,得出浓度-反应曲线,分析得到套锁纤维与钩状纤维最大收缩百分比时对应的胃动素溶液浓度;（2）通过逆转录多聚酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction , RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）法检测套索纤维和钩状纤维中胃动素受体的表达规律;（3）应用皂苷制备可通透套锁纤维和钩状纤维单细胞悬液,分别观察抗胃动素血清（1:100）、磷脂酶C抑制剂U-73122(10-6mol/L)、三磷酸肌醇受体拮抗剂肝素（10μg/mL）对胃动素引起套锁纤维和钩状纤维的收缩反应变化规律;（4）通过[35S]GTPγS结合实验,观察G蛋白水平变化;（5）观察特异性G蛋白抗体（Gαi3、Gαs、Gαq/11）对胃动素作用的影响,分析与胃动素受体耦联的G蛋白的类型。结果:（1）胃动素在10-6-10-12mol/L范围内对套锁纤维和钩状纤维均有收缩效应,且呈剂量-效应关系,并且最大反应浓度为10-6mol/L。胃动素引起套索纤维和钩状纤维出现最大收缩百分率分别为（24.1±1.2）%和（21.1±1.0）%,套锁纤维收缩百分率高于钩状纤维（t=3.18, P=0.004）;（2）RT-PCR和Western blot显示套索纤维和钩状纤维中均存在胃动素受体的表达,并且套锁纤维表达高于钩状纤维（t=5.16, P=0.002）;（3）抗胃动素血清可明显限制胃动素对套锁纤维和钩状纤维收缩效应,细胞收缩百分数分别为（5.1±0.5）%（t=5.9, P=0.001）和（7.6±0.4）%（t=8.4, P=0.001）,抗胃动素血清限制套索纤维收缩程度高于钩状纤维（t=3.02, P=0.040）;磷脂酶C抑制剂U-73122明显抑制胃动素对套锁纤维和钩状纤维收缩效应,细胞收缩百分数分别为（13.3±0.8）%（t=9.68, P=0.001）和（12.1±1.5）%（t=6.31, P=0.003）,但两者比较无明显差别（t=1.29, P=0.268）;三磷酸肌醇受体拮抗剂肝素分别阻断胃动素对套锁纤维和钩状纤维收缩效应,细胞收缩百分数分别为（13.8±1.2）%（t=6.91, P=0.002）和（12.9±1.4）%（t=7.12, P=0.002）,两者比较无明显差别（t=0.37, P=0.730）;（4）胃动素使套索纤维和钩状纤维与[35S]GTPγS结合率明显升高（66.5±28.4）%（t=2.86, P=0.046）和（60.1±17.2）%（t=3.20, P=0.033）,但两者比较无明显差别（t=0.32, P=0.764）;（5） Gαi3抗体可明显抑制胃动素对套锁纤维和钩状纤维的收缩效应,细胞收缩百分数分别为（11.1±1.4）%（t=3.22, P=0.032）和（7.9±3.3）%（t=3.52, P=0.025）,但两者比较无明显差别（t=1.10, P=0.333）;Gαs和Gαq/11抗体对胃动素引起套锁纤维的收缩效应无明显影响。表明与胃动素耦联的G蛋白类型是Gi蛋白。结论:胃动素受体在人LES套锁纤维和钩状纤维均有表达,套锁纤维表达高于钩状纤维;胃动素引起套锁纤维和钩状纤维收缩的规律明显不同,套锁纤维收缩反应强于钩状纤维。阐明了介导胃动素引起套锁纤维和钩状纤维收缩的信号转导通路为:胃动素与特异性的胃动素受体结合,通过Gi蛋白与磷脂酶C偶联,产生三磷酸肌醇,使胞内三磷酸肌醇敏感的钙库释放Ca2+,引起套锁纤维和钩状纤维收缩。第二部分胃泌素对人类LES套索纤维和钩状纤维的调节作用及其信号转导通路目的:胃泌素是脑肠肽的一种,是促进胃肠运动的重要激素。有研究显示短暂性LES松弛与胃泌素相关。本文主要讨论胃泌素引起套锁纤维和钩状纤维收缩规律及其信号转导通路。方法:选取2009年5月至2010年10月期间因食管中段癌于河北医科大学第四附属医院行手术治疗患者5例,术中分别收集套锁纤维和钩状纤维。（1）制备游离的套锁纤维和钩状纤维单细胞悬液,不同浓度胃泌素溶液(10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-12mol/L)作用于套锁纤维和钩状纤维引起收缩反应,随后应用2.5%的戊二醛终止反应,并记录套锁纤维和钩状纤维的长度变化。应用GraphPad Prism5.0软件对数据进行非线性回归分析,得出浓度-反应曲线,得到套锁纤维与钩状纤维发生最大收缩幅度时胃泌素溶液浓度;（2）应用皂苷制备可通透套锁纤维和钩状纤维单细胞悬液,分别观察胃泌素抗血清（1:100）、磷脂酶C抑制剂U-73122(10-6mol/L)、三磷酸肌醇受体拮抗剂肝素（10μg/mL）对胃泌素引起套锁纤维和钩状纤维的收缩反应变化规律;（3）通过[35S]GTPγS结合实验,观察G蛋白水平变化;（4）观察特异性G蛋白抗体（Gαi3、Gαs、Gαq/11）对胃泌素作用的影响,分析与胃泌素受体耦联的G蛋白的类型。结果:（1）胃泌素在10-6-10-12mol/L范围内均对套锁纤维和钩状纤维产生收缩效应,呈剂量-效应关系,并且最大反应浓度为10-6mol/L。胃泌素引起套索纤维和钩状纤维出现最大收缩百分率分别为（27.3±0.7）%和（23.7±0.6）%,套锁纤维收缩百分率高于钩状纤维（t=3.88, P=0.018）;（2）胃泌素抗血清可分别阻断胃泌素对套锁纤维和钩状纤维收缩效应,细胞收缩百分数分别为（10.9±1.1）%和（14.2±0.5）%,抗胃泌素血清限制套索纤维收缩程度高于钩状纤维（t=3.20, P=0.033）;磷脂酶C抑制剂U-73122分别阻断胃泌素对套锁纤维和钩状纤维收缩效应,细胞收缩百分数分别为（13.1±2.1）%（t=6.15, P=0.004）和（11.4±2.0）%（t=4.71, P=0.009）,两者比较无明显差异（t=0.54, P=0.620）;三磷酸肌醇受体拮抗剂肝素分别阻断胃泌素对套锁纤维和钩状纤维收缩效应,细胞收缩百分数分别为（13.5±0.7）%（t=9.1, P=0.001）和（12.2±2.1）%（t=3.08, P=0.037）,两者比较无明显差异（t=0.57, P=0.602）;（3）胃泌素使套索纤维和钩状纤维[35S]GTPγS结合率明显升高（72.1±14.5）%（t=3.11, P=0.036）和（36.5±14.2）%（t=3.01, P=0.039）,两者比较无明显差别（t=1.61, P=0.182）;（4） Gαi3抗体可明显抑制胃泌素对套锁纤维和钩状纤维的收缩效应,细胞收缩百分数分别为（10.6±1.2）%（t=7.41, P=0.002）和（8.8±0.6）%（t=4.56, P=0.010）,两者比较无明显差别（t=1.03, P=0.362）; Gαs与Gαq/11抗体对胃泌素引起套索纤维收缩百分数分别（25.6±1.7）%（t=0.43, P=0.688）和（24.6±5.1）%（t=0.69, P=0.528）,对钩状纤维收缩百分数分别为（19.3±2.0）%（t=0.81, P=0.460）和（20.6±5.4）%（t=0.29, P=0.785）,表明与胃泌素耦联的G蛋白是Gi。结论:胃泌素受体在人LES套锁纤维和钩状纤维均有表达;胃泌素引起套锁纤维和钩状纤维收缩的规律明显不同,套锁纤维收缩反应强于钩状纤维。阐明了介导胃泌素引起套锁纤维和钩状纤维收缩的信号转导通路为:胃泌素与特异性的胃泌素受体结合,通过Gi蛋白与磷脂酶C通路偶联,产生三磷酸肌醇,使胞内三磷酸肌醇敏感的钙库释放Ca2+,引起套锁纤维和钩状纤维收缩。第三部分促胰液素对人类LES套索纤维和钩状纤维的调节作用及其信号转导通路目的:促胰液素是一种重要的胃肠调节激素,属于脑肠肽。生理剂量的促胰液素即可抑制胃运动,使胃舒张。本文主要讨论促胰液素引起套锁纤维和钩状纤维舒张变化规律及其信号转导通路。方法:选取2009年5月至2010年10月期间因食管中段癌于河北医科大学第四附属医院行手术治疗患者5例,术中分别收集套锁纤维和钩状纤维。（1）制备游离的套锁纤维和钩状纤维细胞悬液,不同浓度促胰液素溶液(10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-12mol/L)作用于套锁纤维和钩状纤维引起舒张反应,随后应用2.5%的戊二醛终止反应,并记录套锁纤维和钩状纤维的长度变化。应用GraphPad Prism5.0软件对数据进行非线性回归分析,得出浓度-反应曲线,得到套锁纤维与钩状纤维最大舒张幅度时促胰液素溶液浓度;（2）应用皂苷制备可通透套锁纤维和钩状纤维单细胞悬液,分别观察促胰液素抗血清（1:100）、AC激动剂Forskolin(10-6mol/L)、cAMP抑制剂对促胰液素引起套锁纤维和钩状纤维的舒张反应的变化;（3）通过[35S]GTPγS结合实验,观察G蛋白水平变化;（4）观察特异性G蛋白抗体（Gαi3、Gαs、Gαq/11）对促胰液素作用的影响,分析与促胰液素受体耦联的G蛋白的类型。结果:（1）促胰液素在10-6-10-12mol/L范围内均对套锁纤维和钩状纤维有舒张效应,并呈剂量-效应关系,并且最大反应浓度为10-6mol/L。促胰液素引起套索纤维和钩状纤维出现最大舒张百分率分别为（29.2±0.6）%和（23.9±0.5）%,套锁纤维舒张百分率高于钩状纤维（t=6.05, P=0.026）;（2）促胰液素抗血清可分别阻断促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为（7.5±0.9）% （t=40.2, P=0.001）和（11.2±1.0）%（t=21.6, P=0.002）,两者比较差异有显著性（t=6.39, P=0.024）;腺苷酸环化酶激动剂Forskolin分别增强促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为（40.0±2.3）%（t=4.8, P=0.041）和（30.7±1.8）%（t=4.7, P=0.040）;cAMP抑制剂分别阻断促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为（17.2±1.8）%（t=5.14, P=0.036）和（14.7±4.3）%（t=4.76, P=0.041）;（3）促胰液素使套索纤维与钩状纤维[35S]GTPγS结合率明显升高（52.8±19.5）%（t=3.33, P=0.029）和（44.9±20.9）%（t=3.23, P=0.032）,两者比较无明显差异（t=0.83, P=0.455）;（4） Gαs抗体可明显抑制促胰液素对套锁纤维和钩状纤维的舒张效应,细胞舒张百分数分别为（9.9±2.33）%（t=7.78, P=0.016）和（8.7±1.9）%（t=4.38, P=0.048）;Gαi3和Gαq/11抗体对促胰液素引起套锁纤维舒张效应无明显影响,细胞舒张百分数分别（27.7±4.5）%（t=0.36, P=0.753）和（28.2±2.0）%（t=0.65, P=0.582）;对钩状纤维亦无明显影响,细胞舒张百分数分别为（22.6±1.2）%（t=0.718, P=0.547）和（21.5±4.6）%（t=0.758, P=0.528）。表明与促胰液素耦联的G蛋白类型是Gαs蛋白。结论:促胰液素受体在人LES套锁纤维和钩状纤维均有表达;促胰液素引起套锁纤维和钩状纤维舒张的规律明显不同,套锁纤维舒张反应强于钩状纤维。部分说明介导促胰液素引起套锁纤维和钩状纤维舒张的信号转导通路为: Gαs蛋白耦联于腺苷酸环化酶,催化三磷酸腺苷生成环一磷酸腺苷,后者参与平滑肌细胞的舒张。
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