论文摘要
目的:急性肺损伤（ALI）是临床常见的危重症,死亡率高,以炎症反应和肺泡毛细血管内皮细胞损伤为主要病理改变。已有研究表明, ALI本质是一种炎症;多种炎症介质和细胞因子在内毒素性ALI病理过程中发挥着关键作用。目前临床对ALI治疗虽已采取多种积极措施,但尚未取得突破性进展。最近研究表明,过氧化物酶增殖体激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs）具有抗炎作用,故我们推测:PPARs对ALI的肺组织可能具有一定程度的保护作用,而PPARs在ALI病程中的基因、蛋白表达及其对炎症是否具有保护作用尚待研究。PPARs有三种亚型,即PPAR-α、PPAR-β/δ（亦称PPARδ或NUC 1）和PPAR-γ。本实验主要针对其中两种亚型PPAR-α、PPAR-γ进行相关研究:采用静脉注射脂多糖（LPS）复制大鼠ALI模型后,观察PPAR-α、PPAR-γ在ALI肺组织的表达情况;然后,分别采用PPAR-α、PPAR-γ的激活剂、拮抗剂、激活剂和拮抗剂联合以及此二激活剂联合对大鼠ALI模型进行干预,观察其对大鼠内毒素性ALI肺组织表达PPAR-α、PPAR-γ的影响以及其在ALI发生发展过程中的保护作用。为临床应用PPAR-α、PPAR-γ激活剂治疗内毒素性ALI提供理论基础和实验依据。方法:1.采用颈静脉注射LPS的方法复制大鼠内毒素性ALI模型,按完全随机原则将216只Wistar大鼠分入正常对照组（ND组）、脂多糖致伤组（LD组）、wy14643处理组（LW组）、Troglitazone处理组（LT组）,MK886处理组（LM组）、GW9662处理组（LG组）,wy14643+ MK886处理组（LWM组）,Troglitazone + GW9662处理组（LTG组）,wy14643+Troglitazone处理组（LWT组）,每组分为1h、2h、4h、8h四个时相点,每个时相点6只老鼠。具体方法:对照组（ND组）静脉注射10%DMSO 3ml/kg,30min后注射生理盐水2.5ml/kg;致伤组（LD组）大鼠经静脉注射10%DMSO 3ml/kg,30min后注射LPS 5mg/kg（溶于生理盐水）;各处理组分别先给大鼠静脉注射wy14643 3mg/kg（溶于10%DMSO）、Troglitazone 3mg/kg（溶于10%DMSO）、MK886 3mg/kg（溶于10%DMSO）、GW9662 1mg/kg（溶于10%DMSO）、wy14643 3mg/kg+MK886 3mg/kg（间隔15min）、Troglitazone 3mg/kg+GW9662 1mg/kg（间隔15min）、wy14643 3mg/kg+ Troglitazone 3mg/kg（间隔15min）,然后间隔30min后,再给大鼠静脉注射LPS 5mg/kg （于注射LPS完毕后开始计时）。在1h、2h、4h、8h时相点活杀大鼠。采集各组大鼠标本,测定动脉血氧分压（PaO2）和肺组织湿干重比（W/D）;邻连茴香胺法测定肺组织MPO活性;采用半定量RT-PCR方法测定肺组织中PPAR-αmRNA、PPAR-γmRNA以及TNF-αmRNA的表达水平;免疫组织化学染色法测定肺组织PPAR-α和PPAR-γ蛋白表达水平;ELISA法测定肺组织匀浆上清和血浆中TNF-α浓度水平;Western Blot法检测肺组织胞核蛋白中NF-κB P65蛋白的活性;并进行肺组织病理形态学观察。结果:1.正常对照组大鼠肺组织有PPAR-α和PPAR-γ表达,均主要分布在肺泡上皮细胞;LPS致伤组大鼠PPAR-α和PPAR-γmRNA及蛋白表达较对照组显著降低（P<0.05）。2.Wy14643和Troglitazone分别使ALI肺组织中PPAR-α和PPAR-γmRNA及蛋白表达在各时相点较LPS致伤组有不同程度升高,以2h、4h升高最显著（P<0.05）;Wy14643 +MK886、Troglitazone +GW9662使ALI肺组织中PPAR-α和PPAR-γmRNA及蛋白表达在各时相点较正常组有不同程度降低（P<0.05）,但与LD组相比无明显差异（P>0.05）。MK886使ALI肺组织中PPAR-αmRNA及蛋白表达在各时相点较Wy14643 +MK886组进一步降低（P<0.01）;GW9662使ALI肺组织中PPAR-γmRNA及蛋白表达在各时相点较Troglitazone +GW9662组进一步降低（P<0.01）。3.wy14643+Troglitazone使ALI肺组织中PPAR-α和PPAR-γmRNA及蛋白表达在各时相点较LPS致伤组有不同程度升高（P<0.05）;与Wy14643、Troglitazone单独干预组比较,PPAR-α和PPAR-γmRNA及蛋白在各时相点的表达均无明显差异（P>0.05）。4. Wy14643和Troglitazone均能在各时相点显著抑制ALI肺组织中TNF-αmRNA表达,抑制肺组织和血浆中TNF-α蛋白的表达（P<0.05）;Wy14643+MK886、Troglitazone+ GW9662较正常组增强ALI肺组织中TNF-αmRNA和肺组织、血浆中TNF-α蛋白表达（P<0.05）,与LD组相比无明显差异（P>0.05）。MK886和GW9662均使各时相点ALI肺组织中TNF-αmRNA表达分别较Wy14643+ MK886组、Troglitazone+ GW9662组增强,使肺组织和血浆中TNF-α蛋白的表达增高（P<0.05）。5.Wy14643+ Troglitazone组较单独使用Wy14643和Troglitazone组进一步抑制ALI组织中TNF-αmRNA表达和肺组织、血浆中TNF-α蛋白的表达（P<0.05）。6.LPS致伤组大鼠肺组织中NF-κB明显活化;单独使用Wy14643、Troglitazone处理均显著抑制各时相点ALI肺组织中NF-κB的活化（P<0.05）;Wy14643 +MK886、Troglitazone +GW9662组对NF-κB的活化与LD组相比无明显差异（P>0.05）;而单独使用MK886、GW9662使各时相点ALI肺组织中NF-κB的活化进一步增强（P<0.05）。7.Wy14643+ Troglitazone组各时相点较单独使用Wy14643、Troglitazone组进一步抑制ALI肺组织中NF-κB活化（P<0.05）。8.单独使用Wy14643、Troglitazone能改善PaO2、大鼠肺组织W/D比值、肺组织病理积分,抑制肺组织MPO活性（P<0.05）;使用拮抗剂MK886、GW9662使上述作用减轻（P<0.05）;Wy14643+Troglitazone联合使用使PaO2、W/D比值、病理积分较Wy14643、Troglitazone单独使用进一步改善（P<0.05）,肺组织MPO活性显著受抑。结论:1.LPS复制的ALI大鼠模型中,肺组织PPAR-α和PPAR-γ表达显著减少,提示PPAR-α和PPAR-γ可能参与ALI的炎症反应。2.Wy14643显著上调ALI大鼠肺组织PPAR-αmRNA和蛋白的表达;Troglitazone显著上调ALI大鼠肺组织PPAR-γmRNA和蛋白的表达;Wy14643和Troglitazone联合作用显著上调ALI大鼠肺组织PPAR-αmRNA、PPAR-γmRNA及其蛋白的表达,但较激活剂单独使用无显著差异（P>0.05）。3.Wy14643和Troglitazone通过阻止NF-κB的活化,抑制TNF-α基因和蛋白的表达,降低肺组织MPO活性,对ALI肺组织起到一定程度的保护作用,减轻ALI肺组织的炎症,改善PaO2。MK886和GW9662可分别对抗Wy14643、Troglitazone的作用。Wy14643联合Troglitazone较单独使用此二激活剂更进一步阻止NF-κB的活化,抑制TNF-α的表达,降低肺组织MPO活性,使ALI肺组织的炎症进一步减轻,改善PaO2更明显。单独使用Wy14643和Troglitazone对ALI具有一定程度的保护作用;两者协同较单独使用对ALI肺组织的保护作用增强。
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