胆汁性肝硬化大鼠肾脏组织的HO-1的表达和肾细胞凋亡的研究

论文摘要

肝硬化肾功能损害是肝硬化患者死亡的主要原因之一,表现为自发性少尿或无尿、氮质血症、稀释性低血钠和低尿钠等。肝硬化时肾功能损害的原因未明,可能是由于严重肝功能障碍导致肾脏的血流动力学改变所致,其肾脏血流动力学改变的特征是:肾内血管收缩,肾血流重新分布,血流自肾皮质向髓质分流,肾皮质缺血,肾小球入球小动脉收缩,肾小球滤过率下降。尽管此时体循环扩血管因子可因过度产生和灭活障碍而升高,但肾脏缩血管因子活性却占优势。因此,随着肝硬化病程加重,肾血管收缩逐渐加剧,肾血管阻力增加,导致肾血流灌注量和肾小球滤过率降低,最终导致进行性少尿、无尿、血肌酐和尿素氮水平升高,从而发生肝肾综合征（Hepatorenal syndrome, HRS）。近年研究发现一氧化碳（Carbon monoxide,CO）同一氧化氮（Nitric oxide,NO）一样,也是一种重要的气体信号分子,除参与中枢神经系统的信号传递外,它在血管张力调节中也起重要作用。这一发现提示我们研究一氧化碳是否也参与了肝硬化时肾脏血管的调节。HO是血红素分解代谢的限速酶,催化血红素转化成为等分子量的胆绿素、一氧化碳和游离铁。自从1972年Kerr首次提出凋亡的概念,对凋亡的研究得到了广泛、深入的发展。凋亡系形态学现象,具有特异性的形态学改变,表现为细胞核,包括染色质密集于皱缩的核膜下呈边缘化,胞核高度凝集致密,晚期染色体断裂,核碎裂,直至形成凋亡小体。从基因角度看凋亡受到各种基因调节,例如:asp53,c-myc,Bcl-2等。Bcl-2和Bax同属于一个家族,Bcl-2抑制凋亡的发生,Bcl-2受Bax的影响,Bcl-2过表达抑制凋亡的发生,Bax过表达促进凋亡的发生。目的:本实验采用胆总管结扎（common Bile duct ligation,CBDL）制备胆汁性肝硬化大鼠模型,观察胆汁性肝硬化肾脏的病理变化,检测肾组织中HO-1的表达与定位,肾组织中丙二醛含量的变化以及肾脏凋亡情况,并同时检测和凋亡有关的肾组织Bcl-2、Bax蛋白表达水平。旨在探讨肝硬化进程中肾脏的损伤情况,及其在HRS发生机制中的作用。方法:采用Sprague-Dawley大鼠,CBDL方法制备动物模型,共30只。随机分为假手术组（sham operation, so）、2周组（2 wk）和5周组（5 wk）。采用病理染色观察肝硬化形成情况,病理及电镜观察相对应的肾脏组织学改变;应用免疫组化技术观察HO-1蛋白在肾脏的表达和分布;留取大鼠24小时尿及术中采集静脉血检测血肌酐,并计算内生肌酐清除率;应用分光光度比色法检测肾组织丙二醛（MDA）含量;应用原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL）即TUNEL法检测肾组织细胞凋亡指数（AI）。免疫组化法检测肾组织Bcl-2,Bax蛋白表达水平,病理图象分析系统处理切片染色结果。结果:病理观察显示CBDL大鼠2 wk时肝纤维化形成,5 wk时肝硬化形成。在2wk及5wk各组大鼠肌酐清除率逐渐降低（P<0.05）。CBDL大鼠5wk时肾组织光镜病理切片HE染色显示,肾小管上皮细胞有脱落、坏死现象;电镜显示基底膜不规则增厚,系膜区增宽,上皮细胞足突融合。在5 wk组大鼠肾脏HO-1阳性细胞数及细胞浆内黄染颗粒减少,阳性面积（12.90±3.90）明显低于2wk组（60.47±1.78,P=0.00）和假手术组（53.04±12.79,P=0.00）,而假手术组与2wk组大鼠无明显差异（P=0.122）。肾组织MDA测定结果显示,5wk组（4.07±0.51）较2wk组（2.32±0.85,P=0.00）和假手术组（0.79±0.37,P=0.00）数值有升高,2wk组较假手术组有升高（P=0.00）,表明随着大鼠肝硬化进展肾组织MDA含量逐渐增加。肾组织经TUNEL染色后,可见凋亡细胞簇状堆积,核膜变厚,染色质固缩或呈块状堆积于核膜边缘,有的肾小管甚至出现坏死、脱落和细胞聚集现象。5wk组肾组织凋亡细胞明显增多,凋亡面积（68.36±8.71）显著性高于2wk组（24.08±2.59,P=0.00）和假手术组（11.43±2.77,P=0.00）,2wk组和假手术组比较有差异（P=0.00）。免疫组化显示假手术组,Bcl-2表达相对灰度值为1.36±0.19,Bax为1.23±0.15;2 wk组Bcl-2表达相对灰度值为1.08±0.09,Bax为1.50±0.19;5wk组Bcl-2表达相对灰度值为0.75±0.13,Bax为1.80±0.10。Bcl-2与Bax表达分别呈下降和上升趋势,进一步证明凋亡存在并于凋亡基因的激活与抑制有关。从MDA测定值与凋亡面积的相关分析看,两者呈正相关,假手术组（r= 0.9410）,P<0.05;2wk组（r=0.9113,P<0.05）;5wk组（r=0.8851,P<0.01）。结论:1 CBDL CBDL大鼠随着肝硬化的进展肾脏有病理组织学改变,大鼠的肾脏组织病理学改变随着肝硬化病程的进展而加重。2 CBDL大鼠肾组织HO-1蛋白表达随着肝硬化病变加重而减少,并伴有肾功能逐渐减退与肾血流量减低。3细胞凋亡是CBDL大鼠肾脏损伤发生机制之一,促凋亡相关蛋白表达增加和抑制凋亡蛋白表达减少是细胞凋亡发生的直接生物学因素,氧化应激与自由基增加是肾脏损伤的重要原因。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 胆汁性肝硬化大鼠肾脏组织的HO-1 的表达和肾细胞凋亡的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 血红素加氧酶与肝硬化肾脏血流调节
• 致谢
• 个人简历