基于线粒体12S rRNA基因的PCR-RFLP鉴别混合牛肉及制品的牛种来源研究

论文摘要

线粒体基因组具有种内高度保守性,同时具有很强的抗腐蚀性,其上的12S rRNA基因更具抗腐蚀、耐高温的特点,在国内外被逐渐用于饲料、鲜肉及肉制品的来源追踪和物种成分鉴别等研究。本研究用牦牛、黄牛、水牛作为研究材料,根据食品加工特点,把样品分为新鲜样品和加工模拟组样品。加工模拟组样品进行温度梯度处理（100℃、120℃、140℃、160℃、180℃）研究不同温度下对鉴别的影响。针对不同的样品处理方式采取相应的DNA提取方法提取DNA。对部分新鲜样品组DNA采用连续稀释的办法,使DNA浓度达到相当于实际样品含量的1%,0.1%,0.01%,0.001%,确定鉴别的最低DNA模板浓度。设计引物P1扩增真核生物共有的137bp长度的18S rDNA基因片段作为内源参照验证加工样品提取DNA模板质量的有效性;设计通用引物P2扩增牦牛、黄牛、水牛线粒体12S rRNA基因片段,扩增片段大小为453 bp（黄牛452 bp）,在扩增片段区域寻找牦牛、黄牛、水牛各自不同的特异的酶切位点。通过测序验证酶切位点的正确性。建立了鉴别牦牛、黄牛、水牛的PCR-RFLP分析方法,可用于混合鲜牛肉及制品的牛种来源的鉴别。对分别来自四川、甘肃、云南、陕西、安徽、广东、湖北的2个牦牛品种,8个黄牛品种,4个水牛品种,每个品种采集肌肉样30个,共420个,用该方法分别进行鉴别分析,设计的引物均能扩增出相应PCR产物。对扩增产物用BspHⅠ、EcoNⅠ、HpaⅡ进行酶切,并进行测序验证,结果如下:牦牛12S rRNA基因片段被酶切为203 bp和250 bp,黄牛12S rRNA基因片段被酶切为134 bp和318 bp,水牛12S rRNA基因片段被酶切为86 bp和367 bp,没有交叉酶切现象,通过测序验证了特异性位点和酶切的正确性。经过对样品经过不同温度处理（100℃、120℃、140℃、160℃、180℃）后发现在不同温度处理下均能扩增目的条带,但条带从120℃开始变淡。在优化PCR反应条件情况下,DNA模板浓度在0.01%时,牦牛12S rRNA基因片段酶切条带几乎不可见,得出酶切鉴别的最低DNA模板浓度要求为0.01%。用本研究建立的方法对分别购自雅安、康定、成都超市的24个品牌的牦牛肉干制品进行鉴别,发现仅有3个品牌是牦牛肉,剩余的其中6个品牌是黄牛制品,4个品牌是水牛制品。除此之外的为其它的肉制品。说明牛肉干市场上用黄牛、水牛甚至其它的肉冒充牦牛干制品的现象非常严重。本研究建立的方法是国内首创的可以快速检测牛肉制品中的牦牛、黄牛、水牛成分,可作为检测牛肉制品中牦牛、黄牛、水牛的精确检测手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 牛的分类
• 1.2 牛上常用的分子标记
• 1.2.1 RFLP和PCR-RFLP
• 1.2.2 微卫星标记
• 1.2.3 AFLP标记
• 1.2.4 DNA指纹标记
• 1.2.5 PCR-SSCP标记
• 1.2.6 RAPD标记
• 1.2.7 SNPs标记
• 1.2.8 mtDNA标记
• 1.3 18S rDNA基因
• 1.4 12S rRNA鉴定食品中牛源物质的可行性
• 1.4.1 12S rRNA基因分子特征
• 1.4.2 12S rRNA的二级结构
• 1.4.3 12S rRNA在物种鉴别上的应用
• 1.4.4 国内外对食品中牛源物质鉴定的研究进展
• 1.5 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验样本
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 DNA提取溶液的配制
• 2.1.4 琼脂糖凝胶电泳溶液的配制
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 PCR-RFLP方法的建立
• 2.2.3 鲜样实验组制备
• 2.2.4 加工模拟组制备
• 2.2.5 混合肉制品制备
• 2.2.6 灵敏度确定
• 2.2.7 总DNA提取
• 2.3 PCR扩增
• 2.3.1 引物的评估及PCR条件的设计
• 2.3.2 18S rDNA基因片段的PCR扩增
• 2.3.3 12S rRNA基因片段的PCR扩增
• 2.4 凝胶电泳
• 2.5 12S rRNA基因片段纯化
• 2.6 12S rRNA基因片段酶切
• 2.7 测序验证
• 2.7.1 测序反应
• 2.7.2 测序反应过程
• 2.7.3 测序反应条件
• 2.7.4 测序反应产物的纯化
• 2.7.5 序列测定
• 3 结果与分析
• 3.1.内源参照参基因18S rDNA与12S rRNA基因片段扩增
• 3.2 温度对鉴别的影响
• 3.2.1 加工模拟组扩增结果
• 3.2.2 温度对扩增的影响
• 3.3 酶切特异性
• 3.3.1 酶切鉴别结果
• 3.3.2 酶切特异性分析
• 3.4 灵敏度
• 3.4.1 灵敏度确定
• 3.4.2 灵敏度分析
• 3.5 14个品种420个个体研究结果
• 3.6 测序验证与序列分析
• 3.6.1 酶切位点测序验证分析
• 3.6.2 序列比对分析
• 3.6.3 12S rRNA基因片段序列的碱基组成
• 3.6.4 聚类分析
• 3.7 牛肉干鉴别结果
• 4 讨论
• 4.1 鉴别方法的选择
• 4.1.1 遗传标记的选择
• 4.1.2 片段的选择
• 4.2 酶切位点的寻找
• 4.3 温度对扩增12S rRNA基因片段的影响
• 4.4 内源参照基因的设置
• 4.5 加工模拟组合牛肉干DNA提取
• 4.6 检测灵敏度
• 4.7 酶切的适用性
• 4.8 非牛源物质的排出
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 发表文章