林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因原核表达及免疫原性的初步分析

论文摘要

林蛙“红腿病”是危害林蛙养殖业的主要疾病之一,该病传播快、死亡率高,对林蛙的养殖业的危害严重。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila, AH）是林蛙“红腿病”的主要致病菌。该菌的致病力与毒力因子关系密切,尤其是气溶素（Aer）。气溶素由463个氨基酸组成,分子质量为51.5 ku,是嗜水气单胞菌主要的毒力因子之一,具有溶血性、细胞毒性和肠毒性。该菌的血清型多,在不同的地区、不同的宿主都有所差异,这对灭活苗的使用造成了很大的限制。找出不同血清型菌株共同的保护性抗原,研制出新型亚单位疫苗是现在研究的迫切需求。本试验根据GenBank上报道的嗜水气单胞菌气溶素基因序列（NCBI登录号：DQ186611）,针对该基因的保守区,设计了一对扩增气溶素基因的特异性引物,以从林蛙体内分离的嗜水气单胞菌基因组DNA为模版,用PCR方法扩增目的片段,将该基因克隆pMD18-T载体上,经PCR、酶切及序列测定的鉴定和分析,结果表明成功地克隆了1163 bp的林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因,对所克隆的气溶素基因序列与基因库中已发表的DQ186611进行比较分析同源性高达99%。再将该基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,经PCR鉴定及酶切鉴定,证明成功地构建了原核表达载体pGEX-Aer。将构建好的原核表达载体,经1 mmol/L的IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中进行表达,经过8 h表达量达到最高。该融合蛋白pGEX-Aer的分子量约为69 ku,表达蛋白主要以包涵体形式存在。经Western blotting免疫印记分析,该融合蛋白具有较好的反应原性。将表达蛋白经亲和层析纯化后免疫小鼠,.应用间接ELISA和淋巴细胞增殖试验（MTr）来检测体液免疫和细胞免疫水平。结果表明,表达蛋白能够刺激机体产生较好的体液免疫及细胞免疫水平。证明该融合蛋白具有较好的抗原性,为林蛙嗜水气单胞菌疫苗的研制提供了前期工作。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 嗜水气单胞菌概述
• 2 嗜水气单胞菌对林蛙养殖业的危害及防治
• 2.1 临床症状及病理变化
• 2.2 防治
• 3 嗜水气单胞菌的诊断
• 3.1 细菌学诊断
• 3.2 聚合酶链式反应
• 3.3 间接荧光抗体技术
• 3.4 酶联免疫吸附试验
• 3.5 环节导等温扩增检测技术
• 3.6 单克隆抗体技术
• 3.7 胶体金诊断技术
• 4 嗜水气单胞菌疫苗的研究
• 4.1 灭活苗
• 4.2 活菌疫苗
• 4.3 基因工程苗
• 4.4 口服疫苗
• 5 嗜水气单胞菌的气溶素基因
• 5.1 概述
• 5.2 性质
• 5.3 气溶素的致病性
• 6 本研究的目的及意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 试剂及工具酶
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验所用主要试剂及培养基的配制
• 2 方法
• 2.1 嗜水气单胞菌的培养
• 2.2 DNA的提取
• 2.3 感受态细胞的制备
• 2.4 引物的设计与合成
• 2.5 目的基因Aer的PCR扩增
• 2.6 PCR产物的纯化与回收
• 2.7 目的基因Aer的克隆与鉴定
• 2.8 Aer基因原核表达载体的构建与鉴定
• 2.9 重组表达质粒的诱导表达
• 2.10 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.11 表达产物的Western blotting分析
• 2.12 表达蛋白的纯化
• 2.13 纯化蛋白浓度的测定
• 2.14 动物免疫前准备
• 2.15 动物分组及免疫接种
• 2.16 免疫小鼠血清ELISA抗体水平的检测
• 2.17 免疫小鼠细胞免疫水平的初步检测
• 2.18 数据处理
• 结果
• 1 目的基因Aer的PCR扩增
• 2 重组克隆质粒pMD18-T-Aer的PCR及酶切鉴定
• 3 Aer基因原核表达的鉴定
• 3.1 重组质粒pGEX-Aer的PCR及酶切鉴定
• 3.2 pGEX-Aer的序列测定
• 4 重组表达质粒pGEX-Aer的诱导表达
• 5 融合蛋白的Western blotting分析
• 6 融合蛋白的纯化及浓度测定
• 7 免疫小鼠血清的ELISA抗体检测结果
• 7.1 各免疫组小鼠抗体水平的检测
• 7.2 小鼠T淋巴细胞增殖试验结果
• 讨论
• 1. 蛋白的纯化
• 2 抗嗜水气单胞菌pGEX-Aer融合蛋白多抗的制备
• 3. MTT法检测淋巴细胞的增殖水平
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录