论文摘要
目的:了解黑龙江省肇东市自然人群中乙型肝炎病毒（HBV）基因型、血清亚型分布情况及基因型与血清亚型的关系;了解自然人群中HBV S基因的核苷酸水平变异及氨基酸水平变异情况;分析HBV基因型与临床转归之间的关系。方法:2005年,以黑龙江省肇东市双胜村和先锋村两个农村为研究现场,以全屯居民为研究对象,对全屯居民进行了一次横断面血清流行病学调查,采用固相放射免疫（SPRIA）法检测HBsAg、抗-HBs和抗-HBc三项乙肝病毒感染指标,采用酶联免疫（ELISA）法检测HBeAg和抗-HBe两项感染指标。结合1986年这两个现场的血清流行病学调查资料,综合ALT、B超和临床体检等结果,按照2005年12月10日制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准,选择可作出明确临床诊断的110例作为研究对象。其中无症状HBV携带者（ASC）86例,慢性乙型肝炎（CH）12例,肝硬化（LC）5例,肝细胞肝癌（HCC）1例,恢复6例。男性60例,女性50例。平均年龄36岁。对从110例研究对象中抽取的血清标本采用巢式PCR法扩增HBV DNA。利用QIAamp DNA Blood Mini Kit,按照试剂盒操作说明书要求从200μl血清中提取HBV DNA,将其作为模板,设计合成2对引物扩增HBV S基因。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,应用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行纯化回收。将回收后的产物送生物公司利用ABI 3773自动荧光测序仪测序。利用DNASTAR软件对测序标本的核苷酸序列与从GenBank中获取的HBV A-H各基因型标准序列进行比对分析,绘制基因进化树,确定基因型。由核苷酸序列推导氨基酸序列,确定血清亚型。应用SAS 8.1软件对实验结果进行Fisher确切概率法的统计学处理分析,以P<0.05为有统计学意义。结果: 110例血清标本中,97例HBV DNA阳性,阳性率为88.2%。97例标本的基因型分布为:B基因型9例,占9.3%;C型87例,占89.7%;D型1例,占1.0%。血清亚型分布为:adr亚型77例,占79.4%;adw2亚型11例,占11.3%;ayr亚型8例,占8.2%;ayw2亚型1例,占1.0%。9例B基因型标本的血清亚型均为adw2亚型;87例C基因型标本的血清亚型为: adrq+ 75例（占86.2%）,adrq- 2例（占2.3%）,adw2 2例（占2.3%）;ayr 8例（占9.2%）;1例D基因型标本的血清亚型为ayw2亚型。用Fisher确切概率法对不同基因型的血清亚型构成进行统计分析,P值为0.0000,有统计学意义。9例B基因型感染者中,4例（44.4%）为ASC,5例为CH（55.6%）;87例C基因型感染者中,3例为恢复者（3.4%）,73例为ASC（83.9%）,7例为CH（8.1%）,3例为LC（3.4%）和1例为HCC（1.2%）;1例D基因型感染者为ASC（100%）。Fisher确切概率法对不同基因型的临床转归进行统计分析,P值为0.0288,有统计学意义。本次试验共获得84例HBV S基因540nt完整序列结果。通过对这些核苷酸序列的碱基替换位点以及由核苷酸序列推导出的氨基酸序列的突变位点分析,发现131个位点有碱基替换现象,其中40个位点为同义突变, 89个位点为错义突变,2个位点为无义突变。主要结构同源区（MHR,aa100-160）发现45个位点有碱基替换现象,其中18个位点为同义突变,27个位点为错义突变。错义突变中有2个位点产生了有意义的氨基酸突变—Q129H（1例）和M133L（1例）,位于抗原决定簇a的第一个茎环结构内。1例在aa119120间有三个氨基酸TTE的插入。HBV S基因每100个核苷酸替换的频数为2.19。结论:1黑龙江肇东市HBV基因型分布以C基因型为主,存在少量的B型和D型。2黑龙江肇东市HBV血清亚型分布以adr亚型为主（adrq+和adrq-均有,但以adrq+为主）,存在少量的adw2、ayr和ayw2亚型。3 HBV不同基因型的血清亚型的构成不同。B基因型标本的血清亚型均为adw2;C型标本的血清亚型主要为adr,有少量的adw2和ayr;D型标本的血清亚型为ayw2。提示HBV基因型与血清亚型存在一定的相关性。4 HBV不同基因型的临床转归不同。B基因型感染者中ASC和CH均有,CH与ASC者相比稍多。C基因型感染者中以ASC为主,CH次之,其次为恢复、LC和HCC。提示B基因型感染者较易形成CH,C基因型感染者各种临床转归均有,绝大多数为ASC。5 HBV S基因在许多位点发现碱基替换现象,但近1/3碱基替换为同义突变。自然人群中存在一定的HBV S基因突变,未发现疫苗相关突变。核苷酸替换的平均频数较低,提示S基因相当保守。