论文摘要
背景和目的:缺血缺氧性脑损伤是临床上最常见的脑血管疾病,血管再通后由于再灌注的作用,损伤表现更著,研究其可能的改善及治疗办法具有非常重要的价值。他汀类药物为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase inhibi- tors , HMG-CoA）还原酶抑制剂,是一种临床上广泛使用的降血脂药物。近年来基于其一系列非调脂性脑缺血保护效应,而被广泛应用于缺血性脑血管病。研究发现它具有重要的逆向作用,可减轻产生于脑缺血和再灌注期脑血管和脑实质内的许多病理生理过程。动物实验已证实:他汀类药物可明显减小缺血脑损伤大鼠脑梗死面积,显著减轻其脑水肿程度、改善预后转归。血脑屏障（blood brain barrier, BBB）是维持脑内微环境的重要结构,作为其结构基础的脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells, BMECs）与外周血管内皮细胞不同,在基因、蛋白质组水平及生理结构上均有其特异性。该结构的损伤必将导致脑内微环境的变化,从而引起脑神经细胞功能、代谢与结构的改变。而BBB损伤中,通透性变化是最基本的,也是最直接的损伤体现。因此,探讨他汀对不同缺氧状态下BMECs通透性的影响,能针对性地从细胞水平研究上述动物实验结果的可能机制。本课题拟构建BMECs短暂缺氧（transient hypoxia, TH）、持续低氧（continuous hypoxia, CH）、复氧（reoxygenation, R）模型,观察不同缺氧条件下及他汀类干预后BMECs单层通透性的变化,及基质金属蛋白酶-9（matrix metallopro- teinase, MMP-9）、诱导型一氧化氮合酶（inducednitric oxide synthase, iNOS）、缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor -1α, HIF-1α）的表达情况,并探讨他汀类对不同缺氧条件下BMECs单层通透性影响可能相关机制,为解释其减轻不同氧条件下脑损伤的作用提供实验依据。研究方法:采用2次酶消化加20%BSA离心法分离培养SD大鼠BMECs,用不同缺氧缺糖条件建立BMECs TH、CH、R模型。其中TH组为低糖DMEM培养基环境,置于37℃的3%O2、5%CO2、92%N2低氧培养箱中培养0.5h;CH组为无糖Krebs溶液环境,低氧培养箱中培养12h;R组同CH组处理12h后,更换低糖DMEM培养基置于37℃,5%CO2常氧培养箱中复氧4h。采用BSA通透实验、跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance, TEER）测量并结合CCK-8细胞增殖活性测定以了解不同缺氧条件下BMECs通透性的变化及辛伐他汀（0.1、1.0、10μmol/L）、iNOS抑制剂:硫酸甲基异硫脲（SMT）、MMP-9抑制剂I（MI）、HIF-lα抑制剂:三羟基异黄酮（GEN）干预后的影响;采用iNOS试剂盒测定各组iNOS活性;免疫细胞荧光化学法测定MMP-9、HIF-1α表达,激光共聚焦显微镜摄影后进行计算机图像分析。研究结果:实验一:1.BMECs形态观察及鉴定:BMECs融合后呈紧密连接的铺路石样单层生长;免疫荧光细胞化学法检测vWF蛋白呈阳性表达,阳性率可达95%;生长高峰在3～6d。原代BMECs具有很强的屏障特性。与其相比,第4代后TEER值有显著性下降（P<0.05）。2.不同缺氧条件下BMECs的观察:（1）BSA通透率显示复氧4hBMECs通透率达到高峰,后缓慢下降。TEER测定结果与其一致。（2）与N组相比,TH组、CH组、R组细胞变圆脱落数量逐渐增多,细胞间隙逐渐增大;辛伐他汀干预后各组细胞形态有不同程度改善。N、TH、CH、R组TEER值逐渐降低（P<0.05）,CCK-8细胞增殖活性逐渐增加（P<0.05）。除0.1μmol/L辛伐他汀对R组BMEC的TEER及增殖活性无显著改变外,各浓度辛伐他汀干预能明显改善BMECS的TEER值及细胞增殖活性（P<0.05）。实验二:1.TEER及细胞增殖活性比较10μmol/L辛伐他汀干预能显著改善TH、CH、R组的TEER值及细胞增殖活性（P<0.05）。MI、GEN干预后,TH组TEER值、细胞增殖活性与对照并无显著差异（P>0.05）。经MI、SMT、GEN干预后,CH、R组TEER、细胞增殖活性均有显著改善（P<0.05）。2. MMP-9表达比较MMP-9阳性者于胞浆呈现绿色荧光。与N组对照细胞相比,TH、CH、R组MMP-9表达逐渐增加（P<0.05）。辛伐他汀干预可降低TH组MMP-9表达,但无统计学意义（P>0.05）。辛伐他汀干预能明显降低CH组、R组MMP-9表达（P<0.05）;SMT、GEN干预能明显降低TH、CH、R组MMP-9表达（P<0.05）;MI干预后各组MMP-9表达明显降低（P<0.05）。与MI干预后的MMP-9表达相比,CH、R组中SMT、GEN干预后MMP-9表达更低（P<0.05）。辛伐他汀干预后MMP-9与TEER值的Pearson相关系数为-0.875,p=0.000。3. iNOS活性比较与N组对照细胞相比,TH、CH、R组iNOS活性逐渐增加（P<0.05）。辛伐他汀、MI、GEN干预能明显降低CH组、R组iNOS活性（P<0.05）。SMT干预后TH、CH、R组iNOS活性明显降低（P<0.05）。与SMT干预后的iNOS活性相比,R组中GEN干预后的iNOS活性更低（P<0.05）。辛伐他汀干预后iNOS活性与TEER值的Pearson相关系数=-0.652,p=0.001。4. HIF-1α表达比较HIF-1α阳性者于胞核呈现红色荧光。N组细胞几乎无HIF-1α表达,而TH、CH、R组HIF-1α表达逐渐增加（P<0.05）。经辛伐他汀、MI、SMT干预后能明显增加TH组HIF-1α表达（P<0.05）,CH、R组HIF-1α表达略有增加,但无统计学意义（P>0.05）。GEN干预后TH、CH、R组HIF-1α表达明显降低（P<0.05）,与辛伐他汀、MI、SMT干预后各组均有显著差异（P<0.05）。辛伐他汀干预后HIF-1α表达与TEER值的Pearson相关系数=-0.836,p=0.000。结论:1.本实验成功分离培养SD大鼠BMECs,并建立了BMECs体外短暂缺氧、持续缺氧及缺氧复氧模型。BSA通透实验及TEER测量表明,通透性研究宜采用第四代以前的细胞。三种缺氧模型的BMECs通透性逐渐增加,细胞增殖活性逐渐降低。2.除低浓度辛伐他汀对复氧条件下BMECs的通透性改善作用不明显外,三种浓度辛伐他汀可呈浓度依赖性改善不同缺氧条件下BMECs的通透性。3.抑制iNOS活性可改善BMECs在不同缺氧条件下通透性的增加;MMP-9及HIF-1α表达与持续缺氧、复氧条件下BMECs的通透性增加有关,但轻度缺氧条件下,提高HIF-1α表达反而可能降低BMECs的通透性。缺氧条件下BMECs的MMP-9、iNOS活性可能与HIF-1α有关,而MMP-9的表达亦可能受iNOS活性的调节。4.辛伐他汀对短暂缺氧条件下BMECs的通透性改善作用可能与提高HIF-1α表达有关,而此作用在持续缺氧及复氧条件下可能与抑制MMP-9及iNOS活性有关。
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标签：缺氧论文; 通透性论文; 脑微血管内皮细胞论文; 跨内皮电阻论文; 辛伐他汀论文;